专利名称：抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲肝病毒的免疫学检测，具体地说，涉及抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒。
背景技术：
甲型肝炎病毒(HAV)是感染人类甲型肝炎的主要病原。主要是经粪口传播途径感染，即由病人的潜伏期或急性期粪便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接触经口进入胃肠道而传播。儿童和青少年人群多发。HAV感染的诊断依据是检出HAV的抗体。当前，抗-HAV IgM是早期诊断甲型肝炎的特异性较高的指标，且有简便，快速的优点。 抗-HAV IgM在发病后I周左右即可在血清中测出。因此，可以通过检测抗-HAV IgM来建立诊断甲型肝炎的诊断方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒， 其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原，其中，所述供体微珠包被有含25mM HEPESUOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300，pH7. 2的链霉亲和素溶液；所述受体微珠包被有含 O. 05% Proclin-300, ρΗ7· 2 的 Anti-IgM 的 PBS 溶液。前述的试剂盒，包括供体微珠20 μ g/ml、受体微珠5 μ g/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6X10_8ng/孔；使用时，以总体系10μ I计，每孔添加量为受体微珠4μ I、 供体微珠5 μ I、生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原6Χ l(T8ng及血清I μ I。前述抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒的制备方法，其是将含25mM HEPESUOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300, pH7. 2的链霉亲和素溶液包被至供体微珠上； 将含O. 05% Proclin-300, pH7. 2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受体微珠上；生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备过程为用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍体细胞2BS株，培养细胞至病毒增殖高峰期，14天后收获细胞悬液，经氯仿抽提、PEG沉淀、离心后，用β-丙内酯灭活，浓缩后即得甲肝病毒ΤΖ84株抗原，最后对得到的甲肝病毒ΤΖ84株抗原进行生物素化。具体地，生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原的制备方法包括以下步骤(I)将甲肝病毒ΤΖ84株接种到人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病毒增殖高峰期；(2) 14天后收获的感染细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒；(3)进行氯仿抽提，10%聚乙二醇浓缩，8000r/min，4°C离心Ih ；(4)用含2% SDS的Tris-NaCl缓冲液悬浮沉淀，经蔗糖/甘油不连续密度梯度离心，从底层收获甲肝病毒抗原；其中，蔗糖/甘油不连续密度梯度为0.5ml 80%甘油，1.8ml 30%鹿糖，I. 8ml 20%鹿糖，I. 8111110%鹿糖,I % SDS ;离心条件为 18°C, 37000r/min, 6h ；
(5)用β_丙内酯灭活甲肝病毒抗原后，进行超速离心浓缩；(6)对步骤(5)中得到的甲肝病毒抗原进行生物素化，具体为⑴加入100 μ IffS缓冲液和60 μ I约123 μ g的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中；(ii)离心 IOOOg, IOmin ；(iii)将10 μ I 二甲基亚砜加入到装有NH2-reactive biotin的管中，用移液器吹打混匀；(iv)加入100 μ I反应缓冲液和8μ I NH2-reactive biotin到超滤管中，用移液器吹打混匀，37°C孵育30min ；(V)加100 μ I WS缓冲液到超滤管中，离心lOOOOg, IOmin,弃滤液；(vi)加200 μ I WS缓冲液到超滤管中，离心lOOOOg，lOmin，重复此步骤一次；(vii)加入200 μ I WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物；(viii)分装于200 μ I PCR中，加等量甘油，_20°C保存。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果利用本发明的试剂盒进行甲型肝炎病毒的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，无需洗涤步骤。用试剂盒对93份血清样本进行检测，结果显示灵敏度(真阳性率) =78% ;特异度(真阴性率)=98. 5% ;假阳性率=1% ;假阴性率=22% ;阳性预测值= 95% ;阴性预测值=93% ;准确度=94%。
图I为点杂交(dot-blot)法摸索生物素化甲肝病毒抗原最适浓度的结果。其中， 上排为生物素化甲肝病毒抗原，质量分别180、90、45、22. 5、11. 25、5. 625ng ;下排为未生物素化的甲肝病毒抗原作为对照，质量分别180、90、45、22. 5、11. 25,5. 625ng。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中使用的甲型肝炎病毒(Hapatitis A)TZ84株已在尹等人，病毒学报， 1986，2 (3) :209中公开，该毒株可购自北京科兴生物制品有限公司。实施例一、甲型肝炎病毒释放、浓缩和纯化I、将甲肝病毒TZ84株在人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病毒增殖高峰期；2、14天后收获的感染细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒；3、进行氯仿抽提，10%聚乙二醇浓缩，8000r/min，4°C离心Ih ；4、沉淀物用适量的Tris-NaCl (NT)缓冲液(含质量分数为2% SDS,SDS :十二烷基磺酸钠)悬浮，蔗糖/甘油不连续密度梯度(0.5ml 80%甘油，1.8ml 30%蔗糖，1.8ml 20% 蔗糖，1.8ml 10%蔗糖(含质量份数为1% SDS)37000r/min，18°C离心6h，从底层收获甲肝病毒TZ84株抗原；5、β-丙内酯灭活。二、抗原浓缩
I、二喹啉甲酸(BCA)法测定甲肝病毒抗原浓度为9. 2 μ g/ml,而后分两步进行浓缩第一步15ml，3千道尔顿(KD)超滤浓缩试验材料甲肝病毒TZ84株抗原，200 μ I移液器，15ml 3KD超滤管。试验仪器固定转头离心机。试验步骤(I)在超滤管内加入IOml的甲肝病毒TZ84株抗原；(2)配平，4°C固定转头离心机5000g离心55分钟(min)；(3)收集滤过液；(4)用Iml移液器和200 μ I移液器沿滤膜底部将I. 3ml浓缩液吸入到I. 5mlEP管中。BCA法测定浓缩液和滤过液的浓度分别为43. 2 μ g/ml和3. 2 μ g/ml。第二步0. 5ml, 3KD超滤管浓缩试验材料甲肝病毒TZ84株抗原、Iml移液器、O. 5ml 3KD超滤管。试验仪器小型离心机。试验步骤(I)在超滤管内加入500μ1第一步浓缩的甲肝病毒TZ84株抗原滤过液；(2)配平，14000g，离心30min，收集滤过液；(3)将浓缩管口反向置于外离心管内，2000g，离心30min，收集浓缩液。结果IOml原液可浓缩至160 μ I。BCA法测定浓缩液浓度为205. 2 μ g/ml。三、甲肝病毒抗原的生物素化试验原理生物素与抗原结合，一个抗原分子可连接多个生物素分子，抗原的活性不受影响。试验材料生物素化试剂盒购自Dojindo Molecular Technologies公司(商品编 LK03-10) UO μ I移液器、甲肝病毒抗原、200 μ I PCR管。试验仪器小型离心机。试验步骤(I)加入100 μ IWS缓冲液和60 μ I约123 μ g的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中，离心 IOOOg,IOmin ；(2)另外将10 μ I 二甲基亚砜(DMSO)加入到装有NH2-reactive biotin的管中， 用移液器吹打混匀；(3)加入100 μ I反应缓冲液和8 μ I NH2Teactive biotin到超滤管中,用移液器吹打混匀，37 °C孵育30min ；(4)加100 μ I WS缓冲液到超滤管中，离心lOOOOg, IOmin,弃滤液；(5)加200 μ I WS缓冲液到超滤管中，离心lOOOOg，IOmin,重复此步骤一次；(6)加入200 μ I WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物；(7)分装于200 μ I PCR中，加等量甘油，_20°C保存。结果
BCA法测定生物素化后甲肝病毒TZ84株抗原浓度为125. 5 μ g/ml。加入等量甘油保存，浓度约60 μ g/ml。四、Dot-blot法摸索生物素化甲肝病毒TZ84株抗原的最适浓度I、试验原理生物素能与带HRP标记的SA特异性结合。2、试验材料硝酸纤维素(NC)膜、杂交袋、带HRP标记的SA、生物素化的甲肝病毒 TZ84株抗原，PCR管、显色液。3、试验器材凝胶成像仪。4、试验步骤(I)在一张适当大小的NC膜上用铅笔画二排圆圈，每排6个，第一排为生物素化甲肝病毒抗原，第二排为未生物素化甲肝病毒抗原；(2)在二排的PCR管中分别加入3 μ I PBS,然后在每排第一个PCR管中加入6 μ I 约180ng的生物素化甲肝病毒抗原和未生物素化的甲肝病毒抗原，然后每排第一管中取 3μ I加入到第二管中，依次倍比稀释；(3)从每个PCR管中分别取3 μ I体积的样本到相对应的NC膜圆圈上；(4)待膜上的样本吸收完全，约30min ；(5)将膜装入杂交袋内，加入6ml 5%脱脂奶封闭，以I : 500加入带HRP的SA’ 4°C过夜；(6) PBST 洗膜 3 次，每次 IOmin ；(7)取出置于杂交袋内，加上等体积的A、B显色液；(8)暗室压片IOmin,显影约3min,洗片，定影,洗片。5、试验结果(见表I及图I):表I点杂交法得到的试验结果
权利要求
1.抗甲型肝炎病毒IgMAlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原；其中，所述供体微珠包被有含 25mM HEPESUOOmM NaCl 和 O. 05% Proclin-300, pH7. 2 的链霉亲和素溶液；所述受体微珠包被有含O. 05% Proclin-300,pH7. 2的Anti-IgM的PBS 溶液。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，包括供体微珠20μ g/ml、受体微珠 5 μ g/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6X l(T8ng/孔；使用时，以总体系10 μ I计，每孔添加量为受体微珠4 μ I、供体微珠5 μ I、生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原6Χ 10_8ng及血清I μ I。
3.权利要求I或2所述抗甲型肝炎病毒IgMAlphaLISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将含25mM HEPESUOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300,pH7. 2的链霉亲和素溶液包被至供体微珠上；将含O. 05% Proclin-300, pH7. 2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受体微珠上；生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备过程为用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍体细胞2BS株，培养细胞至病毒增殖高峰期，14天后收获细胞悬液，经氯仿抽提、PEG沉淀、离心后，用丙内酯灭活，浓缩后即得甲肝病毒TZ84株抗原，最后对得到的甲肝病毒 ΤΖ84株抗原进行生物素化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原的制备包括以下步骤(1)将甲肝病毒ΤΖ84株接种到人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病毒增殖高峰期；(2)14天后收获感染的细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒；(3)进行氯仿抽提，10%聚乙二醇浓缩，8000r/min，4°C离心Ih；(4)用含2%SDS的Tris-NaCl缓冲液悬浮沉淀，经蔗糖/甘油不连续密度梯度离心，从底层收获甲肝病毒抗原；其中，蔗糖/甘油不连续密度梯度为0.5ml 80%甘油，1.8ml 30% 鹿糖，I. 8ml 20%鹿糖，I. 8111110%鹿糖,I % SDS ;离心条件为 18°C，37000r/min, 6h ；(5)用丙内酯灭活甲肝病毒抗原后，进行超速离心浓缩；(6)对步骤(5)中得到的甲肝病毒抗原进行生物素化，具体为(i)加入100μ IffS缓冲液和60 μ I约123 μ g的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中；(ii)离心IOOOg, IOmin ；(iii)将10μ I 二甲基亚砜加入到装有NH2-reactive biotin的管中，用移液器吹打混匀；(iv)加入100μ I反应缓冲液和8μ I NH2-reactive biotin到超滤管中,用移液器吹打混匀，37 °C孵育30min ；(V)加100 μ I WS缓冲液到超滤管中，离心IOOOOg, lOmin，弃滤液；(vi)加200μ I WS缓冲液到超滤管中，离心lOOOOg，lOmin，重复此步骤一次；(vii)加入200μ I WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物；(viii)分装于200μ I PCR中，加等量甘油，-20°C保存。
全文摘要
本发明提供了一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒，其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原。本发明通过纯化、浓缩甲型肝炎病毒(HAV)TZ84株抗原并使其生物素化，通过点杂交法摸索出生物素化的HAV抗原的最适量为6×10-8ng/孔。通过优化供体微珠、受体微珠、血清等试验反应条件，建立了抗HAV IgMAlphaLISA检测方法。其优点在于特异性好，灵敏度高，血清用量少，无需洗涤步骤。用该试剂盒对93份血清样本进行检测，结果显示灵敏度(真阳性率)＝78％；特异度(真阴性率)＝98.5％；假阳性率＝1％；假阴性率＝22％；阳性预测值＝95％；阴性预测值＝93％；准确度＝94％。
文档编号G01N33/576GK102608313SQ20121004701
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者董小平, 陈操, 韩俊, 高晨 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所