一种柑橘裂皮类病毒检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种柑橘裂皮类病毒RT?LAMP检测试剂盒，其包括4条特异性引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料。本发明还涉及柑橘裂皮类病毒RT?LAMP检测方法。使用本发明的试剂盒及检测方法能够准确对柑橘裂皮类病毒进行检测或鉴定，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，适合于直接对田间甜橙类品种的带毒情况进行检测。
【专利说明】
-种巧橘裂皮类病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及微生物检测领域，具体地说，本发明设及一种相橘裂皮类病毒RT-LAMP 检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 相橘是世界第一大水果，其国际年贸易额仅次于小麦和玉米，为第=大国际贸易 农产品，在各国的国民经济中占有举足轻重的位置。但是，相橘在生长过程中易受各种病 毒、类病毒及一些原核生物如寄生细菌的感染而致病，从而引起产量变低、品质变劣，严重 的导致植株衰弱，甚至死亡。目前世界上已报道的相橘病毒病和类似病毒病有80多种，给相 橘生产带来很大影响。
[0003] 相橘裂皮病是由相橘裂皮类病毒(Citrus exoco;rtis viroid,CEVd)引起的一种 世界范围的重要相橘病害，在我国分布广泛，可W通过嫁接或修剪用的工具机械传播，主要 危害W积、积澄和兰普来樣作化木的相橘，能够引起化木部树皮纵裂或翅起，最后呈鱗片状 剥落，导致树势衰弱、植株矮化和严重减产。CEVd是马铃馨纺鍾形块茎类病毒属成员，其分 子结构具有高度碱基配对的共扼环状RNA。目前，无毒化生产是防治相橘裂皮病的主要措 施，而无毒化生产要求一种准确、灵敏、简便、快速的检测方法。相橘裂皮类病毒的传统指示 植物检测法虽然稳定可靠，但检测周期长，且需要溫、网室等配套设施;聚丙締酷胺凝胶电 泳和分子杂交等方法，能稳定地检测已经嫁接传播到指示植物上的CEVd,然而由于春季和 冬季类病毒在田间寄主植株内含量低，直接采样检测时稳定性不高；虽然已有应用RT-PCR 方法检测CEVd的分子生物学检测报道，但是仍然存在操作繁琐、取样大、灵敏度不高等问 题。
[0004] 环介导恒溫核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见Notomi T等，Nucleic Acids Res.2000化n 15:28(12) :E63)，而逆转录-环介导等溫扩增技术(RT-LAMP)基于LAMP建立，其在反应体系 中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录和CDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。此外，RT-LAMP还具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点:该技术依赖于能够识别祀序列上6个 特异性区域的引物和具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等溫条件下可W 高效、快速和特异性地扩增祀序列。与RT-PCR相比，RT-LAMP的灵敏度显著较高，优势明显， 可用于准确鉴定田间植株病害，及时监控发病情况，符合产业需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种相橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
[0006] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种相橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒，其包括4条特异性引物，所述引物的核巧酸序列如下所示：
[0007] 外引物F3:TGCCCAGCAATGGTCTA(沈Q ID N0:1)
[000引 外引物B3:GCGCATGCTCATAGTACGAA(SEQ ID N0:2)
[0009] 内引物FIP:CGGCTAACCGTGGTCATGAACC-GGCTCTCGAAAAGCTCTGG(SEQ ID N0:3)
[0010] 内引物BIP: TAGAAGTCGTGATGGCCGTCGA-CCCGATCAGCTAGACGTTAC(沈Q ID NO: 4)。
[0011] 进一步地，本发明的试剂盒还包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核 酸染料，其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10 X化ermoPo 1反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成。
[0012]在本发明的试剂盒中，优选外引物F3和外引物B3的浓度均为0.2皿OlAil，内引物 FIP和内引物BIP的浓度均为1.2wiiolAil。
[0013] 在本发明的试剂盒中，优选核酸染料为SYBR Green I。
[0014] 进一步地，本发明的试剂盒还可W包括RNA提取试剂W及阳性对照和阴性对照。
[0015] 在另一个方面中，本发明还提供了使用本发明的试剂盒对相橘裂皮类病毒进行检 测的方法。
[0016] 本发明的相橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对CEVd的包膜蛋白编 码基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳 性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤， 无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适于CEVd的基础实验室和田间检 测。
【具体实施方式】
[0017] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0018] 实施例1相橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒的制备
[0019] 1.1 试剂
[0020] 引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和IOXThermoPol反应 缓冲液购自肥B; AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green巧日TRIZOL Reagent购自 Invitrogen;其余PCR所需试剂购自Sigma。
[0021] 1.2试剂盒的制备：
[0022] 反应缓冲液:包括2mM dNTPJOXlliermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg2+;
[0023] 引物：外引物F3,其核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；外引物B3,其核巧酸序列如 SEQ ID NO: 2所示；内引物FIP，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 3所示，内引物BIP，其核巧酸序 列如SEQ ID N0:4所示。其中两条外引物的浓度为0.2皿OlAU，两条内引物的浓度为1.化 mol/jil。
[0024] 2U的AMV逆转录酶；
[00巧]8U的Bst DNA聚合酶；
[0026] 核酸染料:1000 X SYBR Green I;
[0027] 阳性对照:相橘裂皮类病毒基因组DM;
[002引阴性对照：100mM Tris-HCKpH 8.0)和50mM EDTA。
[0029] 实施例2相橘裂皮类病毒特异性检测
[0030] 2.1 RT-LAMP 特异性检测
[0031] 感染CEVd的厮澄和相橘植株W及感染马铃馨纺鍾形块茎类病毒的相橘植株各1 株，不含病毒的甜澄1株由中国农业科学院相橘研究所提供。将感染CEVd的植株上的单芽和 无芽枝段嫁接于锦澄化木主干下部，后在化木较上方接暗柳澄芽，形成化穗组合，W繁殖病 毒。每株感染植株繁育4株保存苗，W不接种的健康甜澄作为阴性对照。
[0032] 将保存苗嫁接到指示植物化rog香祿上，观察指标植物的生长症状，通过指标植物 法证实保存苗已感染CEVcL
[0033] 使用实施例1制备的试剂盒按照W下步骤对上述样品进行检测：
[0034] 1.利用TRIZ化Reagent提取待测样品RNA，具体方法如下：
[0(X3日](1)剪下适量叶片，充分研磨，再加 Iml Trizol Reagent充分研磨，室溫放置5min;
[0036] (2)加入氯仿20化1，充分振荡30sec，室溫放置5min后，12000 X g，4°C离屯、IOmin;
[0037] (3)取上层水相至新管中，加入等体积异丙醇，室溫放置30min，12000 X g，4°C离屯、 IOmin，弃上清液；
[003引 （4)用DEPC水配置的75 %乙醇洗涂沉淀，7000 X g，4。(：离屯、5min，弃上清液；
[0039] (5)真空干燥RNA沉淀，加入DEPC水SOiil溶解RNA。
[0040] 2.在PCR管中制备的RT-LAMP反应体系，其包括4条引物各化1、反应缓冲液2.5 、AMV逆转录酶化1、Bst DNA聚合酶化1、模板化1，加水补充至，并W相橘裂皮类病毒 基因组DNA作为阳性对照，WIOOmM Tris-肥1 pH 8.0和SOmM邸TA作为阴性对照；
[0041 ] 3丄AMP反应:将步骤2的PCR管于63 °C恒溫反应SOmin，随后80 °C 5min失活；
[0042] 4.结果判读:在步骤3的所得反应产物中加入化1 SYBR Green I，如反应液颜色为 澄色，表示结果为阴性，样品中不含CEVd;如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，样品中含 有CEVcL
[00创 2.2检测结果
[0044] 待测染毒保存苗共8株，与其相对应的8份样品的PCR管中均呈现绿色，而感染马铃 馨纺鍾形块茎类病毒的植株样品、健康甜澄W及试剂盒中所含阴性对照的PCR显色结果均 为阴性，表明所设计的4条特异性引物能够准确地鉴定出CEVcU并能将其与马铃馨纺鍾形块 茎类病毒属的其他成员区分开来，具有很强的特异性。
[0045] 实施例3相橘裂皮类病毒灵敏度检测
[0046] 3.1 RT-LAMP灵敏度检测
[0047] 取实施例2中鉴定结果为阳性的保存苗RNA样品，并WlO倍浓度系列稀释法稀释成 IOOfg-IOOng 共 7 个梯度。
[0048] RT-LAMP反应及结果判读步骤同实施例2的步骤2-4。
[0049] 3.2检测结果
[(K)加 ]除了DNA浓度为IOOfg的PCR管显示澄色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表 明本发明的检测方法的最低检测极限达到Ipg DNA，灵敏度很高。
【主权项】
1. 一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括4条特异性引物，所述引物的核苷酸 序列为： 外引物F3:TGCCCAGCAATGGTCTA(SEQ ID N0:1) 外引物B3:GCGCATGCTCATAGTACGAA(SEQ ID NO:2) 内引物FIP:CGGCTAACCGTGGTCATGAACC-GGCTCTCGAAAAGCTCTGG(SEQ ID N0:3) 内引物BIP:TAGAAGTCGTGATGGCCGTCGA-CCCGATCAGCTAGACGTTAC(SEQ ID N0:4)。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚 合酶和核酸染料。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10 X ThermoPol反 应缓冲液、〇. 6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成。4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述核酸染料为SYBR Green I。5. 根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其进一步包括RNA提取试剂以及阳性对照和 阴性对照。6. 使用权利要求1-5任一项所述的试剂盒对柑橘裂皮类病毒进行检测的方法。
【文档编号】C12Q1/70GK105861745SQ201610220738
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月9日
【发明人】李勇
【申请人】李勇