一种鸭黄病毒rt-lamp检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测鸭黄病毒的RT-LAMP试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭黄病毒又名鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus)属于黄病毒科 (Flaviviridae)，黄病毒属（flavivirus)。2010年江浙沪一带爆发了一种W蛋鸭产蛋率下 降、生长迟缓、减重、食欲减退、高热及部分死亡为症状的疾病，从病鸭体内分离到了致病病 毒，经过基因序列比对，该病毒被认为是属于一个新的基因型，为TMUV组的黄病毒属的病 〇
[0003] 目前，鸭黄病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测。病毒分离是鸭黄病毒 的传统检测方法；分子生物学检测方法有RT-PCR、套式RT-PCR、巧光定量RT-PCR等，运些 方法操作繁琐、耗时较长。环介导等溫扩增技术是日本学者Notomi于2000年发明的一种 基因恒溫扩增新技术，其特点是针对祀基因的6个区域设计3对特异引物，利用一种链置换 DNA聚合酶在等溫条件化3 °C左右）保溫30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规 PCR相比，该方法不需要电泳及紫外观察等过程，且灵敏度、特异性都优于PCR技术，而且不 需要任何专口的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本低。本发明拟利用LAMP 技术，建立一种灵敏特异，快速简便的检测鸭黄病毒的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测鸭黄病毒的 RT-LAMP的试剂盒，W克服现有技术的不足。
[0005] 本发明为实现上述目的，采用环介导恒溫扩增技术，该技术是在核酸水平上的一 种检测技术，具有准确性好、灵敏度高、操作简单等特点。
[0006] 本发明提供的试剂盒包括W下组分： 1)RT-LAMP反应液：内含浓度为8mmol/LΜ拆04,5.6mmol/LdNTPMixUire; 2 )引物混合液；检测鸭黄病毒的引物组按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB为5nM: 5nM: 40nM: 40nM: 20nM: 20nM的比例混合； 其中所设及的检测引物序列为： 上游内引物FIP序列： 5' - GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG -3'， 下游内引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG-3' . 上游外引物F3序列： 5'-GCAGAAGGAAAACGTCCAGT-3' 下游外引物B3序列： 5'-CCCATGTCAACCCCAGATC-3' ， 上游环引物LF序列 5>-GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT-3>， 下游环引物LB序列 5'-ACCGCTGAGATGGAGGATTATG-3' 3) 酶混合物：浓度均为抓/μL的AMV反转录酶与8000U/mL的BstDNA聚合酶按1 :1 比例混匀分装； 4) 目视巧光染料。
[0007] 5)DEPC水：内含浓度为1%。的焦炭酸二乙醋。
[0008] 6)阴性对照：d地20。
[000引 7)阳性对照：利用鸭黄病毒E基因构建的假病毒颗粒。
[0010] 本发明提供的检测方法具体步骤是： 采集禽类样品后，将样品和本试剂盒中的阳性对照用常规试剂盒提取核酸RNA，从上述 试剂盒中取出RT-LAMP反应液、酶混合物，引物混合液，DEPC水在室溫下融化后，200化/min 离屯、5s;每管测试反应体系加入：RT-LAMP反应液，7. 5μL;引物混合液，6μL;酶混合物， 2μL;目视巧光染料，1μL;DEPC水，3. 5μL;再分别加入处理后制备的阳性对照和样品的 RNA溶液及阴性对照各5μL盖紧管盖，于4000r/min离屯、5s;将PCR管排好，放入63°C水 浴锅水浴1小时或是放入PCR仪运行63°C保溫1小时。
[0011] 反应结束后进行结果检测，具体包括Ξ种： (一）RT-LAMP反应的目视检测方法： 阴性对照呈现浅橘黄色，阳性对照呈巧光绿色，样品根据反应后管内液体的颜色进行 判断阴性阳性。
[0012] (二）RT-LAMP反应的浊度检测方法 反应结束后，将所有PCR管进行离屯、1000化pm，Imin，观察管底，阴性对照管底无沉淀， 阳性对照有白色沉淀，样品根据有无白色沉淀进行判断阴阳性。
[0013] (Ξ)RT-LAMP反应的凝胶电泳检测方法 用含漠化乙锭（EB)的1.5%琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下观察核酸带。阳性对 照扩增产物凝胶电泳后，可见从点样孔的拖尾现象W及很多不同扩增长度的条带，阴性对 照无条带，样品根据电泳后条带有无进行判断阴阳性。
[0014] 有效原则：阳性对照与阴性对照分别成立。
[0015] 本发明的有益效果为： 1)快速：从样品处理到出结果仅需2小时左右；2)在本发明中，筛选出最佳引物浓度 组合，克服了两步法检测鸭黄病毒的不足，实现了一步法RT-LAMP检测鸭黄病毒的目的。3) 灵敏：使用该方法比传统PCR方法灵敏度高10~100倍；4)特异：与常见禽类其他病毒不 发生交叉反应，该方法的特异性高于传统PCR方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阳 性结果；5)本发明提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，因此操作简单，具有良好重复 性。
【附图说明】
[0016]图1.RT-LAMP抑染料结果。1.阴性对照；2.阳性对照。
[0017] 图2.RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳结果。1.阳性对照；2.阴性对照；Μ.DM分子标 准DL2000。
[001引图3.RT-LAMP与RT-PCR灵敏度的比较。A.抑染料结果；B.RT-LAMP琼脂糖凝 胶电泳结果；C.RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果；M.DNA分子质量标准DL2000; 1-9. 10倍 梯度稀释的病毒RNA(101-109)10,阴性对照。
[0019] 图4.RT-LAMP检测方法的特异性试验结果。A.琼脂糖凝胶电泳结果；B.抑染料 结果M.DNA分子标准化2000 1.鸭黄病毒；2.禽流感册N1亚型；3.鸭病毒性肠炎病毒；4、鸭病毒性肝炎病毒。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1.鸭黄病毒RT-LAMP检测试剂盒 试剂盒的组成 1、RT-LAMP反应液：内含浓度为8mmol/LΜ拆04,5.6mmol/LdNTPMixUire; 2、 引物混合液；检测鸭黄病毒的引物组按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB为5nM: 5nM: 40 nM: 40nM: 20nM: 20nM的比例混合； 其中所设及的检测引物序列为： 上游内引物FIP序列： 5' -GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG-3'， 下游内引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG-3'. 上游外引物F3序列： 5'-GCAGAAGGAAAACGTCCAGT-3' 下游外引物B3序列： 5'-CCCATGTCAACCCCAGATC-3'， 上游环引物LF序列 5>-GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT-3>， 下游环引物LB序列 5'-ACCGCTGAGATGGAGGATTA