专利名称：一种检测鸭黄病毒病血清抗体的间接elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，属于动物传染病学领域。
背景技术：
自2010年4月以来，一种由黄病毒引起的种(蛋)鸭产蛋骤降的新发疫病在我国江苏、浙江、山东、河南、福建等地相继发生，可致使产蛋鸭采食量迅速下降、产蛋率急速下降、 甚至停产及不同程度死亡。产蛋率高的鸭群患病后4飞天左右从产蛋高峰的809Γ95%迅速下降至209Γ30%，严重的可在发病后7天左右出现停产；刚开产种(蛋)鸭产蛋率上升缓慢或减蛋、长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现。不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎100%，病死率为(Γ12%。其临床症状除了产蛋骤降外，很重要的一个特征是发生鸭卵巢出血的病鸭伴有摇头扭颈等神经症状，剖检病变主要为卵泡膜出血、充血，卵泡变形萎缩等，部分出现脑膜出血。研究人员从表现产蛋骤降的病死种鸭中采集其卵巢、肝脏、脑等进行病毒分离，经对所分离的病毒进行形态学观察、理化特性测定、RT-PCR检测及序列分析明确该病病原为黄病毒科(/^^iririifee)的一个新成员[1_3]。明确病因是为了更好地做好防治工作。当务之急，做好鸭黄病毒感染的诊断和免疫防制工作是摆在科研工作者、基层兽医和蛋鸭养殖户面前的一件大事，建立鸭黄病毒抗体检测方法，对该病的主动免疫效果评价、血清流行病学调查极有意义，而ELISA方法因其检测通量大、结果确切、灵敏度高而倍受欢迎。目前，Su[4]等已初步建立起检测鸭黄病毒病抗体的ELISA方法，但所建立的方法较为粗糙，数据不明，各种条件尚未优化，不适于临床应用及推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速、简便地检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA 方法，该方法也可对鸭黄病毒病进行快速诊断，以减少损失、提高养殖效益。本发明采取的技术方案如下
以鸭黄病毒作为包被抗原，建立了检测鸭血清中鸭黄病毒抗体的间接ELISA方法。所述鸭黄病毒为鸭黄病毒(Duck fla ν virus) WR株，保藏登记号为CGMCC NO. 4906。所述抗原先经过浓缩，包括如下步骤收集含有鸭黄病毒的胚尿囊液后于4°C、 8000 r/min离心30 min,上清于45000 r/min离心4°C离心2 h,弃上清后沉淀用灭菌PBS 重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70°C。所述病毒浓缩液经蔗糖梯度离心进一步纯化，经超速离心浓缩获得。进一步纯化的步骤为制备10%、20%、30%、40%和50%等5个梯度的蔗糖平衡液， 将病毒浓缩液加在10%蔗糖液上层，于4°C、40000 r/min水平离心2 h ；结果在10%_20%、 30%-40%、40%-50%间发现有病毒带，收集各带后4°C下45000 r/min离心2 h，弃上清后沉淀
3用灭菌PBS重悬，并用RT-PCR方法检测各带的病毒含量，以30%-40%带病毒量最大，得到病毒纯化液，储存于一 70°C为抗原备用。 所述间接ELISA方法包括包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。 所述间接ELISA方法的最佳工作条件为抗原稀释3200倍，样品稀释160倍，酶标
二抗稀释浓度为1:3000，阴阳临界值为0. 43。本发明的显著优点建立的检测鸭黄病毒病抗体的间接ELISA方法，该方法可以对目前我国流行的鸭黄病毒病进行有效的诊断，并可开展大规模的血清流行病学调查，为鸭黄病毒病的防治和流行情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。
具体实施例方式实施例1
本发明的鸭黄病毒抗原，是通过如下方式获得的 (1)抗原的浓缩
用半番胚大量培养本研究室分离鉴定的一株具有良好免疫活性的黄病毒WR株(菌株的保藏号CGMCC No. 4906，来源于申请人申请的一项发明专利申请号为201110143407. 6， 一种鸭黄病毒及其灭活疫苗)，收集含有病毒的胚尿囊液后于4°C、8000 r/min离心30 min, 上清于45000 r/min离心4°C离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70°C。(2)抗原的纯化
抗原的纯化是通过蔗糖梯度离心及超速离心加以浓缩获得。制备10%、20%、30%、40%和 50%等5个梯度的蔗糖平衡液，在10%蔗糖液上加上病毒浓缩液，于4°C、40000 r/min水平离心2 h后。在10%-20%、30%-40%、40%-50%间发现有病毒带，收集各带后4°C下45000 r/ min离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬。并用RT-PCR方法检测各带的病毒含量，以 30%-40%带病毒量最大，得到病毒纯化液，储存于一 70°C为抗原备用。实施例2
本发明的鸭黄病毒病阳性血清和阴性血清，是通过如下方式获得的 (1)阳性血清
以WR株病毒纯化液(实施例1步骤(2)得到的病毒纯化液)用甲醛灭活后与弗氏完全佐剂按1 :1比例进行乳化，然后免疫成年开产蛋鸭，间隔15 d后再次免疫，三免后心脏采血、离心收集血清，于56°C灭活后并经中和试验证明为鸭黄病毒病阳性血清、备用。(2)阴性血清
采集没有感染鸭黄病毒或未免疫过鸭黄病毒病疫苗的健康鸭的全血，离心后收集上清，于56°C灭活，并经中和试验证明为鸭黄病毒病阴性血清。实施例3
本发明的鸭黄病毒病抗体间接ELISA检测方法的最适抗原抗体浓度、酶标二抗体浓度及临界值，是通过如下方式获得的 (1)最适抗原抗体浓度
以矩阵法测定。以纯化的抗原(病毒纯化液)用包被液按1 100、1 200、1 400、1 800、 1 1600、1 3200、1 6400、1 12800,1 25600 进行稀释，包被于 96 孔 Costar 酶标板，4°C过夜后，以PBST洗涤3次后用5%脱脂牛奶37°C封闭2 h，以PBST洗涤3次，阴阳性血清以PBS 稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍，每个阴阳性血清滴度重复4次，与包被抗原进行作用2 h，以PBST洗涤3次后以1000倍的酶标二抗进行反应1 h后洗涤3次，TMB 显色15 min后以2 mol/L H2S04终止反应，并测定每孔的0D450值。由阴阳性血清的每个滴度的平均值的比值(P/N值)测定得到，在抗原稀释3200倍，血清稀释160倍时，P/N值最高，高达6.5，且阳性血清的00450值为1.092( 1)，所以抗原抗体最佳稀释浓度为抗原稀释3200倍，血清稀释160倍。(2)酶标二抗体浓度
以纯化的抗原用包被液按1:3200进行稀释，包被于96孔Costar酶标板，4°C过夜后， 以PBST洗涤3次后用5%脱脂牛奶封闭2 h，以PBST洗涤3次，阴阳性血清以PBS稀释160 倍，每个阴阳性血清滴度重复4次，与包被抗原进行作用2 h，以PBST洗涤3次后用酶标二抗(1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800 和 1:25600 稀释)进行反应 1 h 后洗涤3次，TMB显色15 min后以2 mol/L H2S04终止反应，并测定每孔的0D450值。由阴阳性血清的每个滴度的平均值的比值(P/N值)测定得到，在酶标二抗稀释1 1600和1 3200 时，二者P/N值最高，分别达14和8. 16。但阳性血清的0D450值分别为2. 661和0. 922，调整酶标二抗浓度(1 1500、1 2000、1 2500、1 3000和1 3500)重新测定各个滴度的P/N值， 得到1 3000酶标二抗浓度的P/N值最大(P/N值为9)，且0D450值1. 094。故酶标二抗最佳稀释浓度为1:3000。(3)临界值
通过测定30份阴性血清获得。以纯化的抗原用包被液按1:3200进行稀释，包被于96 孔Costar酶标板，4°C过夜后，以PBST洗涤3次后用5%脱脂牛奶37°C封闭2 h，以PBST洗涤3次，阴性血清以PBS稀释160倍，与包被抗原进行作用2 h，以PBST洗涤3次后用酶标二抗(1 3000稀释)进行反应1 h后洗涤3次，TMB显色15 min后以2 mol/L H2S04终止反
应，并测定每孔的0D450值。求得平均值JT为0. 2096，标准差SD = 0. 0719，所以阴阳临界值=X + 3SD = 0. 2096 + 3X0. 079 = 0. 426 ^ 0. 43，因此判定样品OD值如果高于临界
值即为阳性，低于临界值即为阴性。(4)特异性检验
以免疫过H9亚型禽流感疫苗、H5亚型禽流感疫苗、减蛋综合征疫苗、鸭瘟疫苗、鸭大肠杆菌病疫苗鸭群血清抗体进行特异性检验。采集免疫过H9亚型禽流感疫苗、H5亚型禽流感疫苗、减蛋综合征疫苗、鸭瘟疫苗、鸭大肠杆菌病疫苗的鸭群全血各10份，离心后收集血清备用；以纯化的抗原(实施例1步骤(2)得到的纯化液)用包被液按1:3200进行稀释，包被于96孔Costar酶标板，4°C过夜后，以PBST洗涤3次后用5%脱脂牛奶封闭2 h，以PBST 洗涤3次，将H9亚型禽流感、H5亚型禽流感、减蛋综合征、鸭瘟、鸭大肠杆菌病血清、阳性血清、阴性血清以PBS稀释160倍，与包被抗原进行作用2 h，以PBST洗涤3次后用酶标二抗 (1:3000稀释)进行反应1 h后洗涤3次，TMB显色15 min后以2 mol/L H2S04终止反应， 并测定每孔的0D450值。结果免疫过H9亚型禽流感疫苗、H5亚型禽流感疫苗、减蛋综合征疫苗、鸭瘟疫苗、鸭大肠杆菌病疫苗的鸭群的血清和阴性血清的0D450值均低于0. 43，而阳性血清0D450值高于0. 43。(5)重复性检验重复3次对阴、阳性血清的检测。以纯化的抗原用包被液按1:3200进行稀释，包被于96孔Costar酶标板，4°C过夜后，以PBST洗涤3次后用5%脱脂牛奶封闭2 h，以PBST 洗涤3次，阳性血清和阴性血清以PBS稀释160倍，与包被抗原进行作用2 h，以PBST洗涤 3次后用酶标二抗(1:3000稀释)进行反应1 h后洗涤3次，TMB显色15 min后以2 mol/ LH2S04终止反应，并测定每孔的0D450值。结果阴性血清的0D450值均低于0. 43，而阳性血清0D450值均高于0. 43。(6)对临床样品的检测实例
某蛋鸭场饲养1500只，按常规免疫程序接种了 H5，H5 + H9禽流感疫苗。应场方的要求，产蛋前我们采集20份血样分离血清，对H5和H9抗体进行检测，结果H5和H9血清抗体均大于41呢2。该鸭场产蛋高峰时产蛋率为85%，之后产蛋率在7天内突然下降到30%，我们采集30份血样分离血清，同时加上检测H5和H9抗体的20份血清，按已建好的鸭黄病毒病血清抗体间接ELISA检测方法进行检测。结果产蛋前血清抗体0D450均低于0. 43，最高的为0. 28 ；产蛋率下降后血清抗体的0D450值参差不齐，仅有33%的血清低于0. 43，其它均高于临界值，最高为1. 582，以此诊断该鸭群感染鸭黄病毒。参考文献
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(4)Jingliang Su, Shuang Li, Xudong Hu, Xiuling Yu, Yongyue Wang, Peipei Liu, Xishan Lu, Guozhong Zhang, Xueying Hu, Di Liu, Xiaoxia Li, Wenliang Su, Hao Lu, Ngai Shing Mok, Peiyi Wang, Ming Wang, Kegong Tian, George F. Gao. Duck Egg-Drop Syndrome Caused by BYD Virus, a New Tembusu-Related Flavivirus [J]. PLoS One. , 2011 Mar 24;6(3):el810权利要求
1.一种检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于以鸭黄病毒作为包被抗原，建立了检测鸭血清中鸭黄病毒抗体的间接ELISA方法。
2.根据权利要求1所述的检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于 所述鸭黄病毒为鸭黄病毒Ofcd /Yaririrtt^ WR株，保藏登记号为CGMCC NO. 4906。
3.根据权利要求1所述的检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于 所述抗原先经过浓缩，包括如下步骤收集含有鸭黄病毒的胚尿囊液后于4°C、8000 r/min 离心30 min，上清于45000 r/min离心4°C离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70°C。
4.根据权利要求1所述的检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于 所述病毒浓缩液经蔗糖梯度离心进一步纯化，再经超速离心浓缩获得。
5.根据权利要求4所述的检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于 进一步纯化的步骤为制备10%、20%、30%、40%和50%等5个梯度的蔗糖平衡液，将病毒浓缩液加在10%蔗糖液上层，于40C >40000 r/min水平离心2 h ；结果在10%-20%、30%_40%、 40%-50%间发现有病毒带，收集各带后4°C下45000 r/min离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌 PBS重悬，并用RT-PCR方法检测各带的病毒含量，以30%-40%带病毒量最大，得到病毒纯化液，储存于一 70°C为抗原备用。
6.根据权利要求1所述的检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于 所述间接ELISA方法包括包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。
7.根据权利要求6所述的检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于 所述间接ELISA方法的最佳工作条件为抗原稀释3200倍，样品稀释160倍，酶标二抗稀释浓度为1:3000，阴阳临界值为0. 43。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测鸭黄病毒病血清抗体的间接ELISA方法，以鸭黄病毒作为包被抗原，建立了检测鸭血清中鸭黄病毒抗体的间接ELISA方法。该方法可以对目前我国流行的鸭黄病毒病进行有效的诊断，并可开展大规模的血清流行病学调查，为鸭黄病毒病的防治和流行情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。
文档编号G01N33/569GK102384975SQ201110232858
公开日2012年3月21日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者万春和, 傅光华, 施少华, 李敏, 梁昭平, 王斌, 王鑫, 程龙飞, 许芬芬, 陈红梅, 黄瑜 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所