专利名称：预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种动物预防医药领域，具体为一种预防动物疫病发生的注射液的制备方法。
背景技术：
鸭出血性卵巢炎(鸭黄病毒病)是由黄病毒属坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)，引起种鸭和蛋鸭的急性传染病，以突发产蛋急剧下降为特点，因该病主要导致卵泡变性、变形，卵泡膜充血、出血，暂将该病称为鸭出血性卵巢炎，涉及面广、发病率高、死亡率 5% _30%，病鸭发热，精神欠佳，草绿色下痢，站立不稳，双腿瘫痪、向后或侧面伸展；病变主要见于卵巢，表现为卵巢发育不良，卵泡变性、变形，卵泡膜充血、出血，子宫及输卵管黏膜未见异常，部分病例可见卵黄性腹膜炎报道[曹贞贞，张存，黄瑜等。鸭出血性卵巢炎的初步研究。中国兽医杂志2010年(第46卷)第12期3-7]。给饲养鸭禽的单位或个人带来极大的经济损失，同时，由于对病亡的鸭禽处理不当，往往造成病毒的漫延，产生更大的恶果。目前，社会上尚未发现一种高效专用于预防鸭坦布苏病毒疫病的有效药物，这是鸭禽饲养单位或个人最感头痛的事。本发明的目的是提供一种安全性好、无副作用、保护率高、保护期长、产生作用时间短、使用方便的防鸭坦布苏病毒注射液及制备方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种预防鸭出血性卵巢炎(鸭黄病毒属_坦布苏病毒 (Tembusu virus, TMUV)病，以下简称“鸭出血性卵巢炎或鸭坦布苏病毒病”)的蜂胶注射液， 该注射液对鸭出血性卵巢炎具有较好的预防效果。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述所述预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液由蜂胶水溶液、接种鸭黄病毒属_坦布苏病毒并感染后死亡的鸭胚勻浆组织和灭活液组成，所述蜂胶水溶液、鸭胚勻浆组织的重量比为8-9 1-2，所述蜂胶水溶液为体积分数为0. 1-2% ；所述灭活剂为青霉素、链霉素和福尔马林液，预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含有2000单位的青霉素和2000单位的链霉素，所述福尔马林在预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中体积分数为0. 4%。本发明的目的之二在于提供一种预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法， 该方法操作简单，适用于大规模生产。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，具体包括以下步骤a将接种鸭黄病毒属_坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)种毒并感染死亡后鸭胚制成鸭胚勻浆组织，与蜂胶及水介质混合均勻，得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，所述鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中蜂胶与水介质组成体积浓度为0. 1-2%的蜂胶水溶液，所述蜂胶水溶液与鸭胚勻浆组织的体积比为8-9:1-2 ；b在步骤a所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液。进一步，所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，所述鸭黄病毒属-坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)种毒具体为
a在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏，放入组织捣碎机中捣碎； b取占总量为10-20%的被捣碎的鸭组织与占总重量为80-90%的浓度为0.8 %的生理盐水混合，形成混合组织悬液；
c将混合组织悬液放入离心机中，在离心20-40分钟后取其上清液； d在其上清液中，按每毫升上清液各加入2000单位青霉素和2000单位链霉素的配比加入青霉素和链霉素，得鸭黄病毒病种毒。进一步，所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，步骤a中所述死亡的鸭内脏为卵巢、心、肝、脾、肺和脑中任一种或多种。进一步，所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，所述鸭黄病毒属-坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)种毒接种于9_12日龄的鸭胚尿囊中的剂量为 0. lmL。进一步，所述的预防鸭出血性卵巢炎蜂胶注射液每毫升含2000单位青霉素和 2000单位链霉素，并按总量的0. 4%的配比加入福尔马林液，37-39°C灭活24小时。用本发明所述制备方法制成的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液对于预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)具有显著效果，保护率提高到90-100%，保护期延长到6-12 个月，产生作用时间缩短到5天，仅需一次注射即可达到预期效果。
具体实施例方式实施例1
在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑和卵巢)放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的10%的被捣碎的鸭组织，占总重量的90%浓度为0. 8 %的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4 000转/分条件下离心 20分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000单位青霉素和2 000单位链霉素后即形成鸭出血性卵巢炎种毒。将鸭出血性卵巢炎种毒放入浓度为0. 8%的生理盐水中稀释100倍，形成鸭黄病毒属-坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)种毒稀释液，用 0.1毫升剂量的鸭坦布苏种毒稀释液接种于9日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在48小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚，放入组织捣碎机中捣碎，得鸭勻浆组织，以重量份计取10份的鸭勻浆组织与90份的蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到0. 1 %，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在4000转/分条件下离心20分钟后，取其上清液，即鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0. 4%的福尔马林液， 37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)的蜂胶注射液。实施例2在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑和卵巢) 放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15%的被捣碎的鸭组织，占总重量的85%浓度为 0.8%的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4000转/分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000单位青霉素和2 000 单位链霉素后即形成鸭病毒性卵巢炎种毒。将鸭病毒性卵巢炎种毒放入浓度为0. 8 %的生理盐水中稀释100倍，形成鸭出血性卵巢炎种毒稀释液，用0. 1毫升剂量的鸭出血性卵巢炎稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭勻浆组织，以重量份计取15份的鸭勻浆组织与85份的蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到2%，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在4 000转/分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0. 4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)的蜂胶注射液。实施例3
在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑和卵巢) 放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的20%的被捣碎的鸭组织，占总重量的80%浓度为 0.8%的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4 000转/分条件下离心20分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000单位青霉素和2000单位链霉素后即形成鸭黄病毒病种毒。将鸭黄病毒病种毒放入浓度为0. 8%的生理盐水中稀释 100倍，形成鸭黄病毒病种毒稀释液，用0. 1毫升剂量的鸭黄病毒病种毒稀释液接种于12日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在48小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭勻浆组织，以重量份计取20份的鸭勻浆组织与80份蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到1%，形成混合组织悬液，并其放入离心机中，在4 000转/分条件下离心40分钟后，取其上清液，即鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)的蜂胶注射液。实施例4
在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑和卵巢) 放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15%的被捣碎的鸭组织，占总重量的85%浓度为 0.8%的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4000转/分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000单位青霉素和2 000单位链霉素后即形成鸭出血性卵巢炎种毒。将鸭出血性卵巢炎种毒放入浓度为0. 8%的生理盐水中稀释100倍，形成鸭出血性卵巢炎种毒稀释液，用0. 1毫升剂量的鸭出血性卵巢炎种毒稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭勻浆组织，以重量份计取15份的鸭勻浆组织与85份水介质混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在4000转/分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)的蜂胶注射液。实施例5
在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑、卵巢) 放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15%的被捣碎的鸭组织，占总重量的85%浓度为 0.8%的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4000转/分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000单位青霉素和2 000 单位链霉素后即形成鸭黄病毒病种毒。将鸭黄病毒种毒放入浓度为0. 8%的生理盐水中稀释100倍，形成鸭黄病毒病种毒稀释液，用0. 1毫升剂量的鸭黄病毒病种毒稀释液接种于 11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭勻浆组织，以重量份计取15份的鸭勻浆组织与85份蜂胶水溶液混合，蜂胶终浓度达到3%，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在4000转/分条件下离心30分钟后，取其上清液，即鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)的蜂胶注射液。实施例6
在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏(包括心、肝、脾、肺、脑、卵巢) 放入组织捣碎机中捣碎，取占总重量的15%的被捣碎的鸭组织，占总重量的85%浓度为 0.8%的生理盐水混合，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中在4000转/分条件下离心30分钟，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000单位青霉素和2 000单位链霉素后即形成鸭黄病毒病种毒。将鸭黄病毒种毒放入浓度为0. 8%的生理盐水中稀释 100倍，形成鸭黄病毒病种毒稀释液，用0. 1毫升剂量的鸭黄病毒病种毒稀释液接种于11日龄的鸭胚尿囊中，接种后选取在80小时出血、水肿等特征死亡的鸭胚放入组织捣碎机中捣碎，得鸭勻浆组织，以重量份计取15份的鸭勻浆组织与85份白油乳化液混合，白油乳化液终浓度达到2%，形成混合组织悬液，并将其放入离心机中，在4000转/分条件下离心30 分钟后，取其上清液，即鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，在所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)的蜂胶注射液。实施例7鸭出血性卵巢炎的检测
取实施例1-6中的勻浆组织用TRIzol Reagent RNA提取试剂盒进行病毒RNA的提取，应用RT-PCR的方法进行鸭病毒的检测万春和，施少华，程龙飞，陈红梅，傅光华，彭春香，林芳，林建生，黄瑜。鸭出血性卵巢炎病毒RT-PCR检测方法的建立。福建农业学报 2011，1:10-12，检测结果均为阳性。实施例8无菌检测
取实施例1-6制备的注射液分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂平板，经37°C培养24 小时，按常规方法观察，杂菌检测为阴性。实施例9安全试验选用未免疫的11日龄的肉鸭中，每组10只，按实施例1-6制备的注射液划分，6组和生理盐水空白组，共计7组；每只注射lmL，隔离饲养15天，每日作体温、呼吸、精神、食欲、粪便、等临床观测，注射上述疫苗后，免疫注射组均未引起疫苗发病与死亡，注射部位未见明显的病理变化，无不良反应，精神、食欲佳。实施例10抗体检测
选用未免疫的11日龄的肉鸭中，每组10只，按实施例1-6制备的注射液划分，6组和生理盐水空白组，共计7组；
检测方法间接ELISA检测方法。结果详见表1。
权利要求
1.预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液，其特征在于，所述预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液由蜂胶水溶液、接种鸭黄病毒属-坦布苏病毒并感染后死亡的鸭胚勻浆组织和灭活液组成，所述蜂胶水溶液、鸭胚勻浆组织的重量比为8-9 :1_2，所述蜂胶水溶液为体积分数为0. 1-2%;所述灭活剂为青霉素、链霉素和福尔马林液，预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含有2000单位的青霉素和2000单位的链霉素，所述福尔马林在预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中体积分数为0. 4%。
2.权利要求1所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤a将接种鸭黄病毒属_坦布苏病毒种毒并感染死亡后鸭胚制成鸭胚勻浆组织，与蜂胶及水介质混合均勻，得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液，所述鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中蜂胶与水介质组成体积浓度为0. 1-2%的蜂胶水溶液，所述蜂胶水溶液与鸭胚勻浆组织的体积比为 8-9:1-2;b在步骤a所得鸭胚勻浆组织蜂胶混合液中加入灭活液，使所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液中每毫升含2000单位青霉素和2000单位链霉素，及体积分数为0.4%的福尔马林液，37-39°C灭活，得预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液。
3.根据权利要求2所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，其特征在于，所述鸭黄病毒-坦布苏病毒病种毒具体为a在无菌条件下取因患鸭出血性卵巢炎死亡的鸭内脏，放入组织捣碎机中捣碎；b取占总量为10-20%的被捣碎的鸭组织与占总重量为80-90%的浓度为0.8 %的生理盐水混合，形成混合组织悬液；c将混合组织悬液放入离心机中，在离心20-40分钟后取其上清液；d在其上清液中，按每毫升上清液各加入2000单位青霉素和2000单位链霉素的配比加入青霉素和链霉素，得鸭黄病毒_坦布苏病毒病种毒。
4.根据权利要求2所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，其特征在于，步骤a中所述死亡的鸭内脏为心、肝、脾、肺、卵巢和脑中任一种或多种。
5.根据权利要求3所述的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液的制备方法，其特征在于所述鸭黄病毒-坦布苏病毒种毒接种于9-12日龄的鸭胚尿囊中的剂量为0. lmL。
全文摘要
本发明涉及一种动物预防医药领域，具体为一种预防动物疫病发生的注射液的制备方法，所述预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液由蜂胶水溶液、接种鸭黄病毒属-坦布苏病毒并感染后死亡的鸭胚匀浆组织和灭活液组成；其制备方法为在鸭胚匀浆组织蜂胶混合液加入灭活液，得鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液；用本发明所述制备方法制成的预防鸭出血性卵巢炎的蜂胶注射液对于预防鸭出血性卵巢炎(鸭坦布苏病毒病)具有显著效果，保护率提高到90-100％，保护期延长到6-12个月，产生作用时间缩短到5天，仅需一次注射即可达到预期效果。
文档编号A61P15/00GK102228482SQ20111017713
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者付利芝, 刘作华, 彭祥伟, 殷素会, 粟剑 申请人:重庆市畜牧科学院