专利名称：利用大菱鲆鳍细胞系繁殖大菱鲆出血性败血症病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用大菱鲆鳍细胞系繁殖大菱鲆出血性败血症病毒的方法。
背景技术：
大菱鲆养殖业是我国海水养殖的一个重要支柱产业，但大菱鲆的传染性病毒病的广泛传播，给大菱鲆养殖业带来了巨大的打击，经济损失惨重。如何解决大菱鲆病毒病的预防和治疗问题，已成为当今世界上大菱鲆养殖业中急需解决的重要问题。学者们认为，利用病毒疫苗免疫大菱鲆，是预防大菱鲆病毒病和提高大菱鲆养殖业经济效益的重要途径。在哺乳类和鸟类动物中，已有利用细胞系大规模繁殖病毒和生产病毒疫苗的成功先例，但到目前为止，在海水鱼中还没见报道。
大量的研究表明，只有建立病毒大量繁殖的条件和方法，才能成功制备和生产病毒疫苗，才能成功而有效地进行其病毒病的预防免疫。但至今还没检索到大菱鲆病毒大量繁殖成功的报道，特别是大菱鲆的主要致病病毒——大菱鲆出血性败血症病毒。因此，建立一种利用大菱鲆细胞系进行大菱鲆出血性败血症病毒的繁殖方法，是制备和生产大菱鲆出血性败血症病毒疫苗的核心技术，也是进行大菱鲆病毒病的预防免疫、提高大菱鲆养殖业经济效益的关键技术。
发明内容
本发明的目的就是利用大菱鲆鳍细胞系细胞，提供一种大菱鲆出血性败血症病毒的繁殖方法，以便用于制备和生产大菱鲆出血性败血症病毒疫苗或者科学研究。
首先，取出患病毒性出血性白血症的病鱼的内脏，装入玻璃匀浆器中，添加20毫升无血清MEM培养液后，利用已有的匀浆处理破碎细胞，所得匀浆物进行高速离心后收集合病毒的上清液，利用0.45μm微孔滤膜过滤除菌后，直接用于以下的细胞接种。
将长满单层的大菱鲆鳍细胞系细胞分别接种于10个500毫升培养瓶中，每瓶利用22.5毫升含15％小牛血清的MEM培养液(pH 7.0)22℃进行扩增培养，待细胞长至对数期时，去除原瓶中的培养液，每瓶接种6.75ml过滤除菌后的大菱鲆出血性败血症病毒液，置22℃培养箱中吸附2h后，加入含10％小牛血清的MEM培养液至22.5毫升，置22℃培养箱中培养，于接种病毒后的第4天，无菌条件下用滴管吹打下每个培养瓶的培养细胞，将10瓶培养液和培养细胞的混合物收集于500毫升消毒玻璃瓶中，置于-30℃冰柜中冷冻过夜，再取出冷冻玻璃瓶于水池中流水冲化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，用离心机6000转/分离心30分钟，收集离心上清液，即为大菱鲆出血性败血症病毒液。所得病毒液即可用于制备病毒疫苗，也可再接种于培养细胞进行病毒繁殖。
由此构筑的本发明方法简便、稳定性好，所得的繁殖病毒，数量多、感染能力强，可直接用于病毒疫苗的制备与生产，对于提高养殖大菱鲆的存活率具有明显的效果，实用性强。
具体实施例方式
作为实施例，本发明给出详细具体的制备或繁殖方法。
1、大菱鲆出血性败血症病毒的分离制备将大菱鲆养殖场采集到的患病毒性出血性白血症的病鱼2尾，用解剖剪剪下病鱼内脏(肝脏、脾和胃等)20克左右，装入50毫升玻璃匀浆器中，添加20毫升无血清市售MEM培养液，进行匀浆处理以破碎细胞，待匀浆物成均匀糊状后，收集匀浆物装入50毫升离心管中，于15000转/分离心90分钟，收集离心上清液，于无菌室中用0.45μm微孔滤器进行过滤，以去除细菌而直接用于细胞接种；多余的不马上用于接种的病毒液密封后置4℃冰箱中保存备用。
2、大菱鲆鳍细胞系细胞的扩大培养取5瓶500毫升长满单层的大菱鲆鳍细胞系细胞，去除原有培养液，每瓶加入5毫升0.25％胰蛋白酶消化1.5分钟后，迅速加入22.5毫升新配制的含15％小牛血清的MEM培养液(pH 7.0)，用滴管吹下培养瓶底部的细胞，上述所得的5瓶细胞悬液平均接种于10个500毫升培养瓶中，利用22.5毫升含15％小牛血清的MEM培养液(pH 7.0)22℃进行扩增培养，待细胞长至对数期时用于以下的病毒接种和繁殖。
3、培养大菱鲆细胞的病毒接种与繁殖在无菌室超净台中分别取出6.75毫升上述所得大菱鲆出血性败血症病毒液，分别接种于培养有对数期大菱鲆鳍细胞系细胞的培养瓶中，放入22℃培养箱中吸附2h，每瓶均加入含10％小牛血清的MEM培养液(pH7.0)至5毫升，置22℃培养箱中培养，繁殖大菱鲆出血性败血症病毒。
4、繁殖病毒的收获将已接种大菱鲆出血性败血症病毒的大菱鲆鳍细胞系细胞，连续培养4天后，在无菌室超净台中用滴灌将培养瓶中细胞从瓶底尽数吹下，装入500毫升消毒玻璃瓶中，置-30℃冰柜中冷冻过夜，从冰柜中取出玻璃瓶放入水池中用流水冲刷，让冰冻物融化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，以6000转/分离心30分钟，收集离心所得上清液，即为病毒液，分装入100毫升血清瓶中置4℃冰箱保存备用。将该病毒液用于制备病毒疫苗，或再接种于培养细胞进行病毒繁殖。
权利要求
1.一种利用大菱鲆鳍细胞系繁殖大菱鲆出血性败血症病毒的方法，首先从病毒性出血性白血症病鱼的肝脏、脾、胃和肠组织中，利用组织匀浆和高速离心方法获得病毒液，并用0.45μm微孔滤膜过滤除菌；然后6.75ml病毒液接种至培养在500毫升培养瓶中的对数期大菱鲆鳍细胞系细胞上，在22℃吸附2h后，加入含10％小牛血清的MEM培养液至22.5毫升，置于22℃培养箱中培养，并于接种病毒后第4天，收集培养物，经-30℃冻融1次后，离心收集大菱鲆出血性败血症病毒液上清。
全文摘要
一种利用大菱鲆鳍细胞系繁殖大菱鲆出血性败血症病毒的方法，它是以大菱鲆鳍细胞系细胞为繁殖体系，先将大菱鲆出血性败血症病毒接种至对数期大菱鲆鳍细胞系细胞上，22℃吸附2h后，加入含10％小牛血清的MEM培养液置22℃培养，并于病毒接种后第4天收获培养物，经－30℃冻融1次后，离心收集上清液中的大菱鲆出血性败血症病毒液。本发明所得的繁殖病毒，数量大，感染能力高，可直接用于病毒疫苗的制备与生产，提高养殖大菱鲆的存活率。
文档编号C12N7/02GK1793342SQ20051004518
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者樊廷俊, 丛日山, 王丽燕, 耿晓芬, 杨秀霞, 李明玉, 于秋涛, 孙爱 申请人:中国海洋大学