一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医生物技术领域，设及一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价 的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒(化nine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，是自主复制型 单链DNA病毒，直径约22nm，呈二十面体立体对称结构，无囊膜，壳粒32个。CPV能引起犬的急 性、接触性、高度致死性传染病，临床W剧烈呕吐、出血性肠炎或非化脈性屯、肌炎和白细胞 显著减少为主要特征，有两种临床表现型，出血性肠炎型和屯、肌炎型。W幼犬最易感，发病 率为50~100%，病死率在10~50%，是危害宠物犬、警犬W及其他犬科动物最重要病原之 一。1982年我国首次报道了该病，随后在东北、华北和西南等地区的警犬和良种犬中陆续发 生和蔓延。2001年该病广泛流行，造成了极大的损失。我国2008年修订的《一、二、Ξ类动物 疫病病种名录》将犬细小病毒病列为Ξ类动物疫病。
[0003] 疫苗免疫是预防该病的重要措施，而血凝抑制化I)效价是评价免疫效果的重要指 标，HI效价达到1:80时可W耐受CPV的攻击。目前市场上已有的CPV抗体检测胶体金试纸条 W及其他检测CPV抗体的方法如ELISA试剂盒仅能测血清抗体是否阳性，而无法检测其抗体 HI效价，因此无法确切评价疫苗免疫效果。血凝抑制试验作为检测CPV抗体的一种经典实验 室方法，亦是国家标准方法(GB/T 14926.57-2008)，但该试验的准确性和稳定性与CPV的毒 株、红细胞的来源、反应溫度、缓冲体系及其抑值等多种因素密切相关，不易被操作者所掌 握，加之试验所需材料一一猪红细胞采集、处理、保存问题，试验步骤繁琐等因素严重影响 了该试验方法的广泛应用。
[0004] 胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatogra地y assay,CGIA)是由 固相酶免疫测定技术发展而来的固相标记免疫测定的新技术。该方法具有使用方便快速， 便于基层使用和现场使用；成本低，不需要特殊的仪器设备;结果读取直观等优点，已成为 当前动物疫病检测领域中广泛采用的免疫学检测方法之一。
[0005] 目前，尚未有简便、快速的胶体金试纸条可用于犬血清中CPV抗体HI效价的测定。
【发明内容】
[0006] 根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制 效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[000引一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶 体金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb;在检测线T线上同样 包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb;对照线C线上包被羊抗鼠 IgG，所述CPV治疗性单克隆抗 体为血凝相关单克隆抗体。
[0009] 在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为1-10 μg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml;所述对 照线C线上包被羊抗鼠 IgG的浓度为0.5-2mg/ml。
[0010] 所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗 鼠 IgG的浓度比值为2:1。
[0011] 在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72 μg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为Img/ml;所述对照线 C线上包被羊抗鼠 IgG的浓度为0.5mg/ml。
[0012] 检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，使用16抗原单位的标准抗原时，CGIA效价 乘W4即为犬血清中抗体HI效价;使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘W8即为HI效 价;使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘W2即为HI效价;使用4抗原单位的标准抗原 时，CGIA效价等于HI效价。
[OOU]检测时可使用32、16、8和4个抗原单位的标准抗原。
[0014] 上述的胶体金试纸条，其特征在于，反应时间为10-30min，反应溫度为37±2°C，胶 体金溶液的抑值为8.2。
[0015] 本发明还请求保护包括上述的胶体金试纸条的试剂盒。
[0016] 本发明还请求保护使用上述的胶体金试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方 法。本发明设及的一种CPV治疗性单克隆抗体，由杂交瘤细胞(保藏号CGMCC No. 4304)分泌、 制备腹水并纯化而得。
[0017] 上述单克隆抗体在CPV抗体HI效价检测中的应用。其特征在于，CPV的结构特点是 立体对称的，因此存在多个相同的抗原表位，可同时结合两个W上相同的单抗;在胶体金标 记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb，反应膜检测线(T线)上同样 包被CPV治疗性单克隆抗体McAb，而对照线(C线)上包被羊抗鼠 IgG;检测时，先将样本倍比 稀释后与CPV标准抗原等体积混合，稀释样本中抗体与CPV标准抗原上的血凝素结合，当CPV 标准抗原未完全被中和时，则剩余CPV与Au-McAb结合形成复合物，进而与T线上的McAb结 合显色；当样本中抗体完全中和了CPV标准抗原，则无剩余CPV可与Au-McAb形成复合物，T线 不显色。
[0018] -种利用胶体金免疫层析技术，建立的简便、快速测定CPV抗体HI效价的方法。其 特征在于将犬血清倍比稀释后，分别与16个抗原单位的CPV标准抗原1:1等体积混合，在37 ±2°C反应一段时间后，滴入上述CPV治疗性单克隆抗体制备的胶体金试纸条，WT线消失的 最大血清稀释度乘W 4为犬血清CPV抗体HI效价。
[0019] 本发明中试纸条检测线（T线）消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价即 CGIA效价。
[0020] 本发明中所用单抗为根据国标方法筛选的特异性针对血凝素的单抗，本发明发明 人通过大量的实验验证W及深入的综合分析得出在本发明试纸条的各个相应的生物垫上 包被特定的生物试剂可特异性结合标准抗原(CPV病毒)上的血凝素从而捕获抗原，犬血清 与标准抗原反应后，本试纸条通过是否检测到游离血凝素从而间接反应出犬血清抗体的HI 效价。并在本发明试纸条的各个相应的生物垫上包被特定比例范围的生物试剂可使相应的 效果更加明显。
[0021] 本发明提供了运用试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法，可替代血凝血抑 的方法，大大简便了实验操作并缩短了操作时间，降低了对操作者的要求，扩大了使用范 围。
[0022] 本发明试纸条用于犬血清抗体HI效价的定性检测时，只需将犬血清直接稀释至1: 20(使用16个抗原单位的标准抗原)检测即可，若试纸条检测血清CGIA效价Μ : 20,即HI效 价Μ : 80，则说明免疫合格;若CGIA< 1: 20，即HI效价< 1:80，则说明免疫不合格。同理，使用 其他抗原单位的标准抗原检测时，只需将犬血清分别稀释至1:10(32个抗原单位检测）、1: 40 (8个抗原单位检测）1:80 (4个抗原单位检测）。 杂交瘤细胞保藏信息： 杂交瘤细胞株名称:CPV 1D3 菌株分类:小鼠杂交瘤细胞系 保藏编号为:CGMCC No.4304 保藏日期:2010年11月03日 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC) 保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0023] 图1为试纸条内部结构示意图；
[0024] 图2为试纸条外部结构示意图。
【具体实施方式】：
[0025] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方 式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其 他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本 发明的保护范围之内。
[0026] 本发明实验材料的来源：
[0027] 生物材料：
[00%] CPV治疗性单克隆抗体、CPV标准抗原化A