一种抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种杂交瘤细胞，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C201620。本发明还公开了一种抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的重链可变区互补决定区CDR1和CDR2序列，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区互补决定区CDR1和CDR2序列。所述单克隆抗体可用于诊断和治疗HSV感染或与HSV感染相关的疾病。本发明还公开了一种检测HSV或其感染的细胞的方法，包括：使所述HSV或其感染的细胞与上述单克隆抗体接触，洗去未与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体，然后显示与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体。本发明还公开了一种中和HSV的方法，包括：使所述HSV与权利要求2至4中任一项所述的单克隆抗体接触。CCTCC NO: C20162020160127
【专利说明】
-种抗HSV的糖蛋白g叫勺单克隆抗体从及产生该抗体的杂交 瘤细胞
技术领域
[0001] 本发明设及抗体领域，更特别地设及一种抗HSV的糖蛋白曲的单克隆抗体，W及用 于产生该抗体的杂交瘤细胞。
【背景技术】
[0002] 瘤疹病毒包括一大类的双链脱氧核糖核酸病毒。通常已知的两种病毒是单纯性瘤 疹病毒1型和2型，称为HSV巧日服V2及水痘-带状瘤疹病毒(VZV)。服Vl引起口面病痕，通常被 称为发热性瘤疹或感冒疮。另外，有约30 %的病例生殖器瘤疹由HSVl引起。HSV2比HSVl不常 见，其引起生殖器损害。
[0003] 目前HSV检测方法很多，有病毒培养分离法、HSV病毒抗原检测法、抗体法、PCR法。 病毒培养分离法，是HSV检测方法的金标准，将病毒接种于细胞进行增殖，进而分离鉴定毒 株型别。但此法周期长，要求严格，成本昂贵，操作繁琐，适用于科学研究，不适于临床常规 检测。HSV病毒抗原检测法，临床大多采用酶联免疫吸附法巧LISA)用于皮肤破损处HSV抗原 检测。HSV病毒感染典型者，临床会出现溃瘍、水瘤脈瘤等，用棉签薩取破溃处作标本，用双 抗体夹屯、法检测抗原。此方法敏感性、特异性较强，适合检测临床表现典型者。此外解育溫 度，标本质量和人为操作因素会导致假阳性的出现。抗体法，使用多肤或重组表达病毒蛋白 组分作为抗原有较好的特异性和抗原性，利用酶联免疫吸附实验能够对HSV的IgG进行分型 检测，是临床上常用的检测手段。PCR法，其中FQ-PCR法应用了巧光探针技术，具有高灵敏度 和高特异性的优点，也可作为临床常用的检测手段。
[0004] 尽管临床上有抗病毒化学药物治疗法，但是HSV病毒感染仍然是严重威胁人类健 康的全球性难题。随着免疫缺陷病人耐药性的日益增长，使得探索新的有效的治疗方法显 得极为迫切。
[0005] 本发明筛选的一株能够分泌针对HSV曲的单克隆抗体的融合细胞株，其分泌的单 克隆抗体能够特异的识别HSV-I和HSV-2病毒的曲蛋白，并且能够有效的中和HSV-2病毒感 染细胞。本发明筛选的单克隆抗体能够用于HSV病毒的诊断及其感染的治疗。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了一种杂交瘤细胞株27E1，其于2016年1月27日保藏于中国典型培养 物保藏中屯、（详细地址为：湖北省武汉市八一路229号，武汉大学保藏中屯、），保藏号为： CCTCC NO:C201620。
[0007] 本发明还公开了一种由上述杂交瘤细胞产生的抗HSV的糖蛋白曲的单克隆抗体， 其包含沈Q ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的重链可变区互补决定区CDRl和CDR2序列，W及 SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的轻链可变区互补决定区CDRl和CDR2序列。
[000引进一步地，所述的单克隆抗体的重链可变区由SEQ ID N0:5所示的核酸序列编码， 并且所述单克隆抗体的轻链可变区有SEQ ID N0:6所示的核酸序列编码。
[0009] 本发明公开的单克隆抗体可用于制备诊断HSV感染或与HSV感染相关的疾病的试 剂。
[0010] 本发明公开的单克隆抗体还可用于制备治疗HSV感染或与HSV感染相关的疾病的 药物。
[0011] 本发明还公开了一种检测样品中的HSV或其感染的细胞的方法，包括:使所述样品 与如权利要求2或3所述的单克隆抗体接触，洗去未结合的单克隆抗体，然后显示与所述 HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体，与所述单克隆抗体结合的物质或细胞即为HSV或其 感染的细胞。该检测方法可用于实验室用途，或者可用于医学用途。
[0012] 进一步地，显示与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体可采取免疫化学染 色法或免疫巧光染色法来进行。例如，可提取样品中的总蛋白，在对总蛋白进行SDS聚丙締 酷氨凝胶电泳后，然后进行转膜，用本发明的单克隆抗体解育膜，然后针对本发明的单克隆 抗体的缀合了辣根过氧化物酶的二抗解育，再加入辣根过氧化物酶的底物进行显色来显 示。或者在该免疫印迹方法中，可使用除辣根过氧化物酶W外的其他分子标记或巧光标记。 也可直接将分子标记或巧光标记缀合于本发明的单克隆抗体上。除了使用免疫印迹外，也 可使用免疫组织化学、免疫细胞化学(二者统称免疫化学）W及免疫巧光的方法来实现本发 明。运些方法在本领域中是公知的。
[001引本发明还公开了一种中和HSV的方法，包括:使所述HSV本发明所述的单克隆抗体 接触。该中和方法可用于实验室用途，或者可用于医学用途。
【附图说明】
[0014] 图1为PCR扩增曲1编码片段的电泳图，其中泳道中所示的是编码曲截短的胞外区 (l-343aa)gDl蛋白的核酸片段；
[0015] 图2为原核表达产物跑SDS-PAGE胶后的考马斯亮蓝染色图，其中，泳道1为诱导后 的包涵体，泳道2为诱导后的上清，泳道3为诱导后的全菌液，泳道4为未诱导的菌液，泳道M 为1曰dder m曰rker;
[0016] 图3为原核表达产物跑SDS-PAGE胶后通过western blot得到的电泳图，其中，泳道 1为诱导后的包涵体，泳道4为未诱导的菌液图，泳道M为ladder marker;
[0017]图4为两只免疫小鼠血清中抗体的检测原核表达的曲蛋白和真核表达的曲蛋白 的Western blot图，其中，图的上半部分为将1#小鼠的眼眶血为一抗分别进行1:1000、1: 10000 W及1:100000的比例稀释后对原核表达的曲(泳道1、3、5) W及对真核表达的曲蛋白 (泳道2、4、6)进行检测。NC为未免疫小鼠血清对照(泳道7为原核表达的曲，泳道8为真核表 达的曲）；
[001引图的下半部分为将2#小鼠的眼眶血为一抗分别进行1:1000、1:10000 W及1: 100000的比例稀释后对原核表达的曲（泳道9、11、13) W及对真核表达的神蛋白（泳道10、 12、14)进行检测。NC为未免疫小鼠血清对照(泳道15为原核表达的曲，泳道16为真核表达的 曲）；
[0019]图5为两只免疫小鼠血清中的抗体检测表达有曲蛋白的sf9细胞的巧光图，其中， 固定用杆状病毒表达系统表达曲的sf9细胞，将免疫小鼠的血清分别进行1:300(第2 行）、1:900(第3行）、1:2700(第4行)的梯度稀释作为一抗，阴性对照(第1行)为免疫小 鼠的免疫前血清，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG;
[0020]图6为纯化的抗体溶液跑SDS-PAGE胶后的考马斯亮蓝染色图，其中，泳道1、2、3、4、 5、6分别为纯化后抗体的洗脱液，图中的条带分别为纯化单抗的重轻链；（抗体结合在纯化 柱上后用2mL的洗脱液进行洗脱，洗脱液每20化L 一管，大约10管，1-6为10管中去掉前2管和 后2管后的6管，然后分别取一定量进行电泳）；
[0021 ]图7为标准蛋白浓度-A595值的相关性曲线图；
[0022] 图8为本发明的单克隆抗体检测曲蛋白的Western blot图，其中，a、b和C分别是W S巧细胞表达的曲蛋白（泳道1KHSV-1感染的Vero细胞中的曲蛋白（泳道2)W及HSV-2感染 的Vero细胞中的曲蛋白（泳道3)为抗原的Western blot图，泳道为M为蛋白marker;
[0023] 图9为本发明的单克隆抗体检测感染了HSV的细胞的巧光图，其中，第1列为重组 病毒vAcBac-gD2感染的Sf 9细胞，第2列为服V-2感染的Vero细胞；
[0024] 图10为被本发明的单克隆抗体中和后的HSV-2感染的细胞的活力柱状图，其中1为 单克隆抗体27E1、2为小鼠免疫前血清（阴性对照）、3为免疫小鼠多克隆血清（阳性对照）。
【具体实施方式】
[0025] W下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0026] 实施例1.杂交瘤细胞的制备
[0027] 1.免疫原的制备从HSV-2感染的Vero细胞裂解液中提取病毒的核酸为模板，通过 PCR(所用引物序列：gDl-F: 5 ' -CCGGAATTCGCCACCATGGGGCGTTTGACCTCCG-3 ' gDl-R: 5 ' - CCCAAGCTTCTAGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGATGATCAGGCCC GGGTTG-3 '）扩增得到编码曲截短的 胞外区曲1蛋白的核酸片段（图1)，用EcoRIMindin双酶切，然后将其克隆至原核表达载体 pET-32a上，并命名为祀T-32a-曲1。通过酶切和测序鉴定正确后，W电穿孔的方式将pET- 32a-gDl转入大肠杆菌化21中，IPTG(终浓度为lmM)37°C诱导4小时。通过考马斯亮蓝染色 (图2)和western blot(图3)检测到曲1蛋白表达于包涵体中。
[0028] 2.小鼠免疫从包涵体中纯化曲1蛋白，用弗式完全佐剂（Sigma公司）乳化，分别免 疫2只6-8周龄的BALB/c小鼠（购自中国科学院武汉病毒研究所）。腹部皮下注射每只小鼠6 点，剂量为60yg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏完全佐剂(Sigma公司）乳化，剂量 为30yg/只。4次免疫后，眼眶取血，通过western blot和免疫巧光对2只免疫小鼠血清中抗 体的特异性及效价进行初步评估。如图4和5所示所示，所得到的抗体对在稀释IO5倍后仍 然可用于western blot检测，在稀释2700倍后，仍然可用于免疫巧光检测，并且保持对曲1 蛋白的特异性。
[0029] 3.制备杂交瘤细胞取上述2#免疫小鼠的脾脏细胞，制成无菌细胞悬液化anks液， 配方：化Cl 8.01;KC1 0.4;CaCl2 0.14;Na肥〇3 0.35;KH2P040.06;Glucose 0.34g/l)，与骨 髓瘤细胞SP2/0(中国科学院武汉病毒研究所）W5:1比例融合，15(K)巧m离屯、5min。弃上清后 离屯、管放入37°C水浴中，在1分钟内缓慢加入ImL的Hyb;ri-Max?(Sigma公司），并揽动细胞。 在溫水中静置Imin后，加入IOmL无血清的DMEM(新纵科），混匀，100化pm离屯、5min。弃上清后 加入IOmL血清(GIBC0公司）小屯、的将细胞吹打起来，并加入5血混合10XHAT(Sigma公司）的 胸腺细胞，混匀。再加入25mL含有2.1 %硝基纤维素(Sigma公司）的半固体培养基充分混匀， 然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞放入湿盒中，置于37 °C，5 % C〇2培养箱中培养。 融合7天后，在解剖镜下挑选圆、实、大的克隆团转入事先准备好培养基的96孔板中，放入37 °C，5%C02培养箱中培养。3天后用化ISA的方法对融合细胞进行多轮筛选，并结合Western bolt和免疫巧光实验进行验证，得到细胞株27E1提交至中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC) 保藏，保藏号为:CCTCC N0:C201620。
[0030] 实施例2.用杂交瘤细胞产生单克隆抗体
[0031] 腹水诱生法制备单克隆抗体将对数生长期细胞用无血清培养基洗涂并悬起，取1 X 105，lmL的悬浮细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水，取出的腹 水于4°C离屯、4000巧m IOmin。小屯、吸出中间的腹水收集于离屯、管中，4°C或-20°C保存。用 HiTrap rProte in A(GE公司）亲和层析法从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，如图6 所示，所纯化的抗体溶液纯度很高，只有表示重链和轻链的两条带，基本没有杂带。 化a壯ord法测定浓度(表1)，纯化的抗体保存于-20°C。根据表1中的标准品浓度为横坐标、 对应的A595值为纵坐标做线性关系图并得到线性方程为y = 1.204X+0.732(图7)。将蛋白样 品稀释液的A595值代入该方程，计算出蛋白样品的浓度为0.556mg/mL。
[0032] 表1:标准品蛋白浓度W及样品蛋白浓度与对应的A595值
[0033]
[0034] 单克隆抗体亚类鉴定用IOOmL PBS(化Cl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP〇4 I Ommo I/L，K出P〇4 2mmo I/L，PH7.4)稀释包被羊抗鼠 I gG至0.5iig/mL，每孔加 100化，4 °C 过夜。 倾空液体，用含0.05 %Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200化封闭液(含2 %BSA和3 %薦 糖的PBS)，37°C解育化。倾空液体用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1 mL杂交瘤上清，37°C解育 化。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1:1000稀释HRP标记的羊抗鼠（包含IgMJgGU IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3)抗体（新纵科病毒疾病工程技术有限公司，湖北），每孔加入 0.1血，37 °C解育化。倾空液体用PBS-T清洗3次。每孔加入50化含0.15 % ABTS和003 %出化的 巧樣酸缓冲液进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示读2):本发明 单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。表2纯化的单克隆抗体的亚型鉴定
[00351
[UWW 单克陰抗体nj雙区斤列测足乂用'I'Kizoi试刑提取细胞巧27E1的总KM。巧脫5' 化11 RACE Kit使用说明书中描述的步骤，经过adaptor连接、反转录合成cDNA和outer PCR 反应，获得抗体的轻重链可变区基因片段，将其克隆到T Easy载体上，进行测序。outer PCR 反应所用的上游引物为5'化11 RACE Kit中携带的5'-RACE Outer Primer,下游引物为：重 链 CH-R: CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT;轻链化-R: GGATACAGTTGGTGCAGCATC。 测序得到编码该单克隆抗体的重链可变区序列SEQ ID NO:5和编码该单克隆抗体的轻链可 变区序列SEQ ID N0:6。将编码序列转化成氨基酸序列后，通过分析，其中重链可变区CDRl 和CDR2序列分别为SEQ ID NO:巧日SEQ ID NO: 2所示的序列，轻链可变区CDR巧日CDR2序列分 别为沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4所示的序列。
[0037] 实施例3.检测服V
[0038] 单克隆抗体反应特异性鉴定分别^巾4。8曰。-旨02感染的3巧细胞表达的曲2、^及用 HSV-I或HSV-2(中科院武汉病毒所菌毒种保藏中屯、)感染的Vero细胞作为抗原，用免疫印迹 法检测本发明的单克隆抗体识别曲蛋白的特异性。免疫印迹实验过程如下:分别将sf9细胞 表达的神2蛋白、W及HSV-l和HSV-2感染的Vero细胞样品用5XSampleBuffer(250mM TrisHClpH6.8，lO%SDS，3O%Glycerol，5%0-mercapitalethanol，O.O2%bromophenol blue)裂解并充分煮沸后跑胶，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶4它封闭过夜，用TBST缓 冲液洗膜3次，每次5min。将膜浸入单克隆杂交瘤细胞培养基上清(其中含有杂交瘤细胞分 泌的单抗27E1)中，37°C解育2.化，TBST洗膜3次，每次5min。用含有0.5 %脱脂牛奶的TBS 1: 5000稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，加入到洗好的膜上，37°C解育化。TBST洗涂3次后，用过氧 化物底物（SuperSi即al West Pico Qiemiluminescent Subtrate ,Fementas) W及显影系 统(MicroQiemi Bio-imaging system,DNR)观察目标蛋白。如图8所示，单克隆细胞株27E1 能特异并灵敏的识别sf9细胞表达或服V-I、服V-2感染的Vero细胞中的曲蛋白。
[0039] 分别WvAcBac-gD2感染的sf9细胞表达的曲2、W及用HSV-2(中科院武汉病毒所菌 毒种保藏中屯、)感染的Vero细胞作为抗原，用免疫巧光法检测本发明的单克隆抗体识别天 然构象曲蛋白的特异性。免疫巧光实验过程如下:将Sf9细胞和Vero细胞分别平铺到96孔板 上，每孔约lX104个细胞。贴壁后，用重组病毒vAcBac-gD2感染Sf9细胞(将处于对数生长期 的Sf9细胞接种到小皿中，28°C贴壁培养过夜。次日用脂质体转染法转染扣gAcBac-gD2。转 染后第5-7天，细胞出现明显CPE(细胞变圆、膨大）收集上清即获得重组杆状病毒vAcBac- 曲2。用5个MOI重组杆状病毒vAcBac-gD2感染Sf 9单层细胞，4天后用4 %多聚甲醒固定细胞 样品。），用HSV-2感染Vero细胞，感染后换2%胎牛血清(GIBC0公司）的DMEM培养基(GIBC0公 司），3化后，用4%多聚甲醒固定IOmina XPBS洗涂3次。用新配制的0.15%化iton-X 100透 化IOmin，1 X PBS洗涂3次，每次5min。用5 %的BSA封闭细胞，37 °C解育30min后，1 X PBS洗涂3 次，每次5min。一抗为单克隆杂交瘤细胞培养基上清原液，37 °C解育化，1 XPBS洗涂3次，每 次5min。二抗用FITC标记的羊抗鼠IgG(fluorescein isothiocyanate[FITC]-conjugated； Proteintech)按1:1000稀释，37°C解育化，I X PBS洗涂3次，每次5min，用巧光显微镜观察。 如图9所示:27E1既能识别感染了重组病毒vAcBac-gD2的sf9细胞，也能识别感染了服V-2病 毒感染的Vero细胞。
[0040] 实施例4.体外中和服V
[0041 ] 用Cell Counting Kit(CCK-8/WST-8)试剂盒（碧云天)检测单克隆融合细胞分泌 的抗体对HSV-2的中和活性。具体方法为:在96孔板中接种Vero细胞，每孔约5 X IO3个细胞， 将96孔板放在37°C，5%C02的培养箱中贴壁培养。将0.1个MOI的HSV-2分别与单克隆杂交瘤 细胞培养基上清原液、免疫后鼠多克隆血清（阳性对照)或免疫前血清（阴性对照)于37°C解 育化，之后用解育液感染Vero细胞（lOOiil/孔）。感染后4她向每孔中加入IOiil CCK-8溶液。 将96孔板在37°C解育化，用酶标仪测定450nm处的吸光度。结果如图10所示:单克隆杂交瘤 细胞株27E1分泌的抗体有较强的中和活性。
[0042] W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为：CCTCC N0:C201620。2. -种抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞 产生鼠抗人IgG2亚类的抗体，包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的重链可变区互补决定 区CDRl和CDR2序列，以及SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的轻链可变区互补决定区CDRl和 CDR2序列。3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区由 SEQ ID N0:5所示的核酸序列编码，并且所述单克隆抗体的轻链可变区有SEQ ID N0:6所示 的核酸序列编码。4. 一种如权利要求2或3所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，用于制备诊断HSV感染 或与HSV感染相关的疾病的试剂。5. -种如权利要求2或3所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，用于制备治疗HSV感染 或与HSV感染相关的疾病的药物。6. -种检测样品中的HSV或其感染的细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:使所述 样品与如权利要求2或3所述的单克隆抗体接触，洗去未结合的单克隆抗体，然后显示与所 述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体，与所述单克隆抗体结合的物质或细胞即为HSV或 其感染的细胞。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，显示与所述HSV或其感染的细胞结合的单 克隆抗体采取免疫化学组织化学法、免疫细胞化学法、免疫印迹法或免疫荧光染色法来进 行。8. -种中和HSV的方法，其特征在于，包括以下步骤:使所述HSV与如权利要求2或3所述 的单克隆抗体接触。
【文档编号】C12N5/20GK105925537SQ201610249934
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】张涛, 王华林, 徐浩, 王志英, 李轶, 邓菲
【申请人】中国科学院武汉病毒研究所