一种中缅树鼩脂肪细胞的流式细胞样品制作方法
【专利摘要】本发明涉及细胞样本制作领域，具体涉及一种中缅树鼩脂肪细胞的流式细胞样品制作方法。本发明方法利用4％多聚甲醛进行细胞固定，0.05％Tween进行细胞打孔，制作中缅树鼩脂肪细胞流式样本。使用本发明方法，能有效解决一般情况下细胞通透时造成的大量脂肪细胞破碎，以及离心转速对固定的脂肪细胞造成的破碎的问题，成功制作出符合流式上机要求的脂肪细胞样品，为细胞检测技术提供方法依据。
【专利说明】
一种中缅树齣脂肪细胞的流式细胞样品制作方法
技术领域
[0001]本发明涉及细胞样本制作领域，具体涉及一种中缅树駒脂肪细胞的流式细胞样品制作方法。
【背景技术】
[0002]流式细胞术自20世纪60年代开始发展起来，主要应用于生命科学的基础研究，尤其是细胞生物学、免疫学和分子生物学，是细胞与分子生物学、单克隆抗体技术、生物技术、荧光化学、激光技术、光电子物理、流体力学、计算机技术等多学科领域共同发展的结晶。它不仅能够快速定量分析细胞群的物理化学特征，还能通过这些特征精确分选细胞，主要分为流式细胞分析和流式细胞分选两部分。80年代后期开始应用于临床，并通过对外周血CD4+T细胞的检测来监测HIV患者疾病的进展，开启了用于临床医学的新纪元。现在，流式细胞术不仅能够辅助多种疾病的判断，同时为生物学发展提供了新技术。
[0003]细胞因子是由非免疫细胞或免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的分化、生长和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答起着十分重要的作用。检测细胞因子对于阐明机体免疫应答机制的发生、发展和临床治疗具有重要意义。随着研究进展，仅仅对细胞进行活性的检测和定量已不能满足需要。目前，在单细胞水平上研究细胞因子的表达能力越来越受到重视。应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上正确、客观地检测细胞内多个细胞因子，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法(Pala P,H us sell J,0 penshaw P J.Flow cytomety measure-mentof intracellular cytoki nes[J].Tmmu noI M ethods，2000，243(1-2):107-124)。
[0004]自流式细胞术发展以来多应用于免疫学、肿瘤学、血液、细胞凋亡、细菌学，而实验动物也多为小鼠等啮齿类动物。现有技术方案对于脂肪细胞的研究也多数集中于前体脂肪细胞的分化机制及特异性分子标记物，而缺少流式细胞术对于成熟脂肪细胞的分析、分选。
[0005]此外，现有实验方案一般利用0.1%Triton-100进行细胞通透，但由于脂肪细胞的细胞膜较易破碎，利用0.1 %Triton-100进行细胞通透时会使样品中的大量脂肪细胞破碎，从而影响后续的实验结果，不适合脂肪细胞的流式细胞样品制作，不能得到理想的实验结果。且现有实验方案中离心速度一般在1000-1500rpm，1min，这一转速对脂肪细胞来说转速过大，特别是对已固定后的细胞来说转速过大，会使细胞大量破碎，影响实验操作。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是在于提供一种中缅树駒脂肪细胞的流式细胞样品制作方法，有效解决一般实验方案中0.1 %Triton-100进行细胞通透时造成的大量脂肪细胞破碎，以及离心转速对固定的脂肪细胞造成的破碎的问题，成功制作出符合流式上机要求的脂肪细胞样品。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以解决:
[0008]—种中缅树駒脂肪细胞的流式细胞样品制作方法，其特征在于，包含以下步骤:
[0009](I)动物断颈处死后，分别取下树駒肩胛、耳后、腋下褐色脂肪组织，与腹部大网膜、腹股沟白色脂肪组织，随后泡在磷酸缓冲液(phosphate buffer solut1n，PBS)中，将组织上沾着的毛洗掉；
[0010](2)将组织置于2mL的离心管中，加ImL 0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪将组织剪碎，约Imm3大小，将剪碎的组织块转移至15mL离心管中，胰酶补至4mL，放入37°C水浴锅中温浴，每隔1min摇晃一次，显微镜下观察组织块消化成单细胞的程度，共50-70分钟;若样品较为粘稠，100rpm离心1min仍不能离下沉淀，则补PBS至1mL离心，1500rpm，lOmin，弃上清液，保留沉淀；
[0011](3)将步骤(2)中留取的沉淀用1mL PBS重悬一下，将大的组织块剔除，离心100rpm, 1min，弃上清液，留少量I3BS将松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL离心管中，血细胞经过离心后贴壁较牢，因此可将血细胞剔除，重复用PBS洗一次；
[0012](4)4%预冷的多聚甲醛将细胞重悬，4°C固定过夜，并将固定过夜的细胞用移液枪重悬起来，剔除大的组织块，离心100rpm，1min，4°C，弃上清液，保留沉淀；
[0013](5)将步骤(4)留取的沉淀用ImL PBS重悬，离心，lOOOrpm，1min，4°C，弃上清液，保留沉淀；
[0014](6)在步骤(5)留取的沉淀中加Im L含0.05%的Tween细胞打孔剂，将细胞重悬，打孔30min;
[0015](7)离心800rpm，10min，弃上清液，保留沉淀，并用I3BS洗一遍细胞，加50-100yL的PBS混匀细胞，加入适量的UCPl—抗，室温孵育40min;
[0016](8)加 PBS 至 ImL 混勾，离心 800rpm，lOmin，加 PBS 洗一遍；
[0017](9)按1:2000的比例加入二抗，避光，室温孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至ImL，即可。
[0018]本发明方法避免了传统技术方案中会对脂肪细胞造成大量损伤，使脂肪细胞大量破碎，而无法制作出合格的流式样品。本发明方法制作的中缅树駒脂肪组织流式样品效果较好，且对冷驯化下中缅树駒脂肪细胞进行对比分析，为细胞检测技术提供方法依据。
【附图说明】
[0019]以下结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明。
[0020]图1为70%酒精固定对细胞散射光的影响，其中:A-0.1 % Tri ton-100通透，B-0.05% Tween 通透；
[0021 ] 图2为4 %多聚甲醛固定对细胞散射光的影响，其中:A-0.I % Triton-100通透，B-0.05% Tween 通透；
[0022]图3为冷驯化Od中缅树駒脂肪细胞“典型”WAT流式分析图；
[0023]图4为冷驯化28d中缅树駒脂肪细胞“典型”WAT流式分析图；
[0024]图5为冷驯化49d中缅树駒脂肪细胞“典型”WAT流式分析图；
[0025]图6为冷驯化49d中缅树駒脂肪细胞“典型”BAT流式分析图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于该实施例。
[0027]为顺利制备中缅树駒脂肪细胞流式样品，首先选择具有UCPl表达的褐色脂肪细胞进行样本分析，并选取固定剂为70%酒精或4%多聚甲醛，打孔剂为0.1%Triton-100或0.05%Tween，进彳丁组合探讨最佳方案。其中利用70%酒精进彳丁细胞固定后，再用0.1%Tri ton-100或0.05 % Tween进行细胞打孔，发现染色效果不好，基本没有细胞被染上(参照图1)。而利用4%多聚甲醛进行固定后，再用0.05%Tween进行打孔，发现其染色效果较好，约有70.40%的细胞被染色(参照图2)。因此本发明方法利用4%多聚甲醛进行细胞固定，
0.05% Tween进行细胞打孔，制作中缅树駆]脂肪细胞流式样本。
[0028]实施例
[0029]实施例1白色脂肪细胞的流式分析
[0030]对照组中缅树駒腹部大网膜、腹股沟等“典型”WAT显示出单一的Rl群，且没有UCPl表达(参照图3)。冷驯化4周后，中缅树駒腹部大网膜、腹股沟等“典型”WAT显示出单一的Rl群，用UCPI抗体标记后，有5.70 %的细胞显示为阳性。冷驯化使WAT中出现UCPI表达阳性的细胞群(参照图4)。冷驯化7周后，树駒腹部大网膜、腹股沟“典型” WAT中出现了新的细胞群R2群。其中Rl群用UCPl抗体标记后，有69.64%的细胞显示为阳性。冷驯化使WAT Rl中出现UCPl表达阳性的细胞群。冷驯化新生成的R2群用UCPl抗体标记后，有95.28%的细胞显示为阳性。冷驯化使WAT中出现UCPl表达阳性的细胞群(参照图5)。
[0031 ]实施例2褐色脂肪细胞的流式分析
[0032 ] 冷驯化7周后，树駒肩胛、耳后、腋下BAT中Rl群用UCPI抗体标记后，有67.82 %的细胞显示为阳性。R2群用UCPl抗体标记后，有94.99%的细胞显示为阳性。这说明冷驯化增加了树駒BAT中UCPI的表达，BAT产热活性增强(参照图6)。
【主权项】
1.一种中缅树駒脂肪细胞的流式细胞样品制作方法，其特征在于，包含以下步骤: (1)动物断颈处死后，分别取下树駒肩胛、耳后、腋下褐色脂肪组织，与腹部大网膜、腹股沟白色脂肪组织，随后将其泡在PBS中，并将组织上沾着的毛洗掉； (2)将上述组织置于2mL的离心管中，加ImL0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪将组织剪碎，约Imm3大小，将剪碎的组织块转移至15mL离心管中，加入胰酶补至4mL，放入37 °C水浴锅中温浴，每隔1min摇晃一次，显微镜下观察组织块消化成单细胞的程度，共50-70分钟;若样品较为粘稠，100rpm离心1min仍不能离下沉淀，则补PBS至1mL离心，1500rpm，1min，弃上清液，保留沉淀； (3)将步骤(2)中留取的沉淀用1mLPBS重悬一下，将大的组织块剔除，离心100rpm，1min，弃上清液，留少量PBS将松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL离心管中，将血细胞剔除，重复用PBS洗一次； (4)用4%预冷的多聚甲醛将上述细胞重悬，4°C固定过夜，并将固定过夜的细胞用移液枪重悬起来，剔除大的组织块，离心100rpm，1min，4°C，弃上清液，保留沉淀； (5)将步骤(4)留取的沉淀用ImLPBS重悬，离心，100rpm，1min，4°C，弃上清液，保留沉淀； (6)在步骤(5)留取的沉淀中加ImL含0.05%的Tween细胞打孔剂，将细胞重悬，打孔30min； (7)离心800rpm，1min，弃上清液，保留沉淀，并用PBS洗一遍细胞，加50_100yL的PBS混匀细胞，加入适量的UCPl—抗，室温孵育40min; (8)加PBS至ImL混勾，离心800rpm，1min，加PBS洗一遍； (9)按1:2000的比例加入二抗，避光，室温孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至ImL，即可。
【文档编号】G01N15/14GK105890942SQ201610189049
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】王政昆, 朱万龙, 孙舒然, 高文荣
【申请人】云南师范大学