用于检测树鼩副粘病毒的pcr试剂盒及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中病毒的检测方法，特别是涉及一种树駒副粘病毒 (TPMV)的PCR试剂盒及其专用引物与其在检测树駒副粘病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 树駒副粘病毒（TPMV)是1999年首次由Tidona等人从曼谷捕获的健康 野生树駒的肾组织中分离得到病原体，随后在树駒成纤维细胞和树駒肾细胞中培 养增殖(Tidona CA,Kurz Hff, Gelderblom HR, et al. Isolation and molecular characterization of a novel cytopathogenic paramyxovirus from tree shrews. Virology，1999, 258(2) :425-434.)。由于其在电镜下呈副粘病毒样多形性包膜和螺旋样核 衣壳，因此被命名为树駒副粘病毒。
[0003] 树駒副粘病毒RNA序列长度为17904bp，包括两个不重叠的开放读码框架（对应为 N蛋白和P/V/C蛋白）。树駒副粘病毒的编码策略和显著氨基酸序列同源性清楚地表明树 駒副粘病毒和麻瘆病毒属之间的进化关系。此外，树駒副粘病毒和亨德拉病毒（马麻瘆病 毒）也具有高同源性。
[0004] 树駒副粘病毒与已知副粘病毒均无血清学交叉反应，由于这一血清学特性，目前 被作为溶瘤病毒载体进行基因改造，运用于靶向杀死癌症细胞研宄，具有广阔的临床应用 价值。
[0005] 目前，国外报道的树駒副粘病毒特异性检测方法还是病毒的分离和鉴定。国内尚 未有报道分离出树駒副粘病毒，尚无树駒副粘病毒毒株。国内外尚未报道树駒副粘病毒的 分子生物学检测方法。
【发明内容】
[0006] 针对以上问题，发明人通过对树駒副粘病毒的分子生物学检测方法进行研宄，提 出了一种PCR检测方法，由于其具有特异性、灵敏度高、快速简便等优点，为将其运用于树 駒副粘病毒的早期诊断中提供了一个快速可行的解决方案。
[0007] 本发明的第一个目的是提供用于树駒副粘病毒PCR检测的引物。
[0008] 本发明所提供的引物，是以树駒副粘病毒血凝素基因组序列自5'端第 8231-8720bp区域（序列表中SEQ ID NO :1)为对象设计的，用以检测样品中是否存在树駒 副粘病毒污染。
[0009] 具体来讲，所述引物的上游引物453-F2具有序列表中SEQ ID NO :2所示的核苷酸 序列，下游引物453-R2具有序列表中SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
[0010] 本发明的第二个目的是提供用于检测树駒副粘病毒的PCR试剂盒。
[0011] 本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对树駒副粘病毒进行PCR检测的引物。
[0012] 具体来讲，所述试剂盒包括逆转录反应试剂和PCR反应试剂：
[0013] 25 μ 1 逆转录反应试剂包括：5Xbuffer (Promega AMV Transcriptase， catalog#M5108) 5 μ I，dNTP (浓度 2. 5mM) 4 μ I，随机引物（浓度 500ug/mL) 0· 5 μ I，AMV (浓 度 10U/ul) 0· 5 μ 1，去 Rnase 的 dH20 7 μ 1 ;
[0014] 25 μ I PCR 反应试剂包括：HS Taq 酶（浓度 5u/μ 1)0. 15 μ 1，10Xbuffer (TaKaRa Taq? Hot Start Version DR007A)2. 5 μ 1，dNTP (浓度 2. 5mM)2 μ 1，ddH20 17. 35 μ 1，上游 引物45342(浓度1(^]\〇1以1，下游引物453-1?2(浓度1(^]\〇14 1。
[0015] 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为树駒 副粘病毒阳性质粒，所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系，如双蒸水。
[0016] 上述PCR引物或试剂盒在树駒副粘病毒PCR检测中的应用也属于本发明的保护范 围。
[0017] 本发明的第三个目的是提供一种树駒副粘病毒的PCR检测方法。
[0018] 本发明所提供检测方法，可包括以下步骤：
[0019] 1)提取样本RNA ;
[0020] 2)以样本RNA为模板逆转录合成其cDNA ;
[0021] 3)PCR检测：以步骤2)获得的cDNA为模板，在上述专用引物的引导下进行PCR扩 增，反应结束后对PCR扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为453bp的目 的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。
[0022] 在上述树駒副粘病毒的PCR检测方法中，所述步骤1)的样本是从树駒身上分离得 到的血液、粪便或肾组织。
[0023] 所述步骤2)中是在合适的反应体系中，通过逆转录酶的催化，以样本RNA为模板 合成其DNA (cDNA)的过程，所述25 μ 1逆转录反应体系为：样本RNA (浓度0. 25ug/ul) 8 μ 1， 5Xbuffer (Promega AMV Transcriptase，catalog#M5108) 5 μ 1，dNTP (浓度 2. 5mM) 4 μ 1，随 机引物（浓度 500ug/mL)0. 5 μ 1，AMV(浓度 10U/ul)0. 5 μ 1，去 Rnase 的 dH20 7 μ I ;所述逆 转录反应条件为：37°C 90min，72°C 15min，4°C 5min。
[0024] 所述步骤3)是以样本RNA的逆转录产物为模板，在合适的反应体系中，用本发明 的特异性引物与cDNA相应位置互补结合，经过DNA的变性（基因组双链解成单链）、退火 (引物与模板结合）、延伸（从引物3'端合成新链）3个阶段的循环重复，目的片段被放大， 再通过琼脂糖凝胶电泳进行树駒副粘病毒的定性检测；所述25 μ I PCR反应体系可包括： cDNA (浓度 50ng/ μ I) 1 μ I，HS Taq 酶（浓度 5u/ μ 1) 0· 15 μ 1，10 Xbuffer (TaKaRa Taq? Hot Start Version DR007A)2.5yl，dNTP(浓度 2·5πιΜ)2μ1，ddH20 17·35μ1，上游引物 453-F2 (浓度10 μ Μ) 1 μ 1，下游引物453-R2 (浓度10 μ Μ) 1 μ 1 ;所述PCR反应条件可为：先 94°C 5min ;然后 94°C lmin，48°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环；最后 72°C 10min。
[0025] 为方便检测，所述步骤3)PCR反应体系中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳 性对照为树駒副粘病毒阳性质粒，所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系，如双蒸水。
[0026] 本发明提供了一种树駒副粘病毒的PCR检测方法及其专用引物与试剂盒，具有以 下优点：
[0027] 1.目前国内外尚无树駒副粘病毒PCR检测方法的报道，因此，本发明的发明人首 次构建了树駒副粘病毒阳性质粒，并建立了树駒副粘病毒的PCR检测方法，用该检测方法 可以对从树駒身上分离得到的血液、粪便或肾组织等样本进行定性检测；
[0028] 2.本发明的检测方法具有相当高的灵敏度，灵敏度可达到11. 5X KT5UgAiL ;
[0029] 3.本发明的检测方法具有相当高的特异性，仅用于扩增树駒副粘病毒。
[0030] 综上所述，本发明将在树駒副粘病毒的病原体检测中发挥重要作用，应用前景广 阔。
[0031] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明PCR检测方法的敏感性分析结果
[0033] 图2为本发明PCR检测方法的特异性分析结果
【具体实施方式】
[0034] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（《分子克隆实验指南》）（Sambrook，J·， Russell， David W. ? Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001， NY， Cold Spring Harbor)〇
[0035] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量（W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、 质量/体积（W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积（V/V，单位mL/100mL)百分比浓 度。
[0036] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0037] 所用引物的合成与标准品质粒的制备由宝生物工程（大连）有限公司完成。
[0038] 所有序列测定工作由宝生物工程（大连）有限公司完成。
[0039] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0040] 实施例1、用于对树駒副粘病毒进行PCR检测的引物及PCR检测方法
[0041] 一、设计用于树駒副粘病毒PCR检测的引物
[0042] 以树駒副粘病毒血凝素基因组序列自5'端第8231-8720bp区域（序列表中SEQ ID NO: 1)为模板设计引物，该引物的PCR扩增产物大小为453bp，引物序列如下：
[0043] 上游引物 453-F2:5' -ATTATTCAAATCCTCCACC-3'（序列表中 SEQ ID NO :2);
[0044] 下游引物 453-R2:5' -CTTCCGTACCACAAACTG-3'（序列表中 SEQ ID N0:3)。
[0045] 二、构建树駒副粘病毒阳性质粒
[0046] 由于目前国内未分离到树駒副粘病毒，需制备树駒副粘病毒的阳性质粒作为检测 时的阳性对照，构建方法为：选择树駒副粘病毒血凝素基因组序列自5'端第8231-8720bp 区域（序列表中SEQ ID N0:1)，人工合成约490bp的双链DNA序列，插入pMD18-T载体（购 自宝生物工程（大连）有限公司）自5'端第425bp的克隆位点，得到树駒副粘病毒阳性质 粒，命名为TPMV-质粒。
[0047] 三、树駒副粘病毒的PCR检测
[0048] 用本发明的方法对树駒副粘病毒进行PCR检测，具体方法包括以下步骤：
[0049] I、提取树駒血液、粪便或肾组织样本的RNA
[0050] 可使用商品化试剂盒或按sambrook等人所编《分子克隆实验