磁珠法提取病毒dna/rna的试剂盒以及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种磁珠法提取病毒DNA/RNA的试剂及其使用方法。
【背景技术】
[0002]【背景技术】描述段落分子生物学技术可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测，并将肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平，核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离。
[0003]目前核酸分离技术虽然发展迅速，但是均存在一些缺点:例如:酚氯仿抽提法虽然核酸纯度高，但是其对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，多次换管，步骤繁琐，会造成样本的丢失与污染。碱裂解法:该法提取的核酸不容易保存，并且不能用于提取RNA。硅胶膜吸附柱法提取的核酸DNA/RNA浓度纯度低、实现自动化困难、单位时间通量低。
[0004]磁珠是由四氧化三铁或三氧化二铁等磁性粒子与各种含活性功能基团的二氧化硅材料复合而成的球形微粒，磁珠表面可被赋予多种活性功能基团，如-C00H、-OH等，也可共价结合酶、细胞、抗体等生物活性物质。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，当粒径小于一定值时，磁珠便具有了很好的瞬时磁响应性，也就是超顺磁性，可避免发生中粒子那样的磁性团聚，因为具有超顺磁性，磁珠可在外加磁场的作用下被定为、导向和分离。表面结合的特殊基团以及活性物质可以特异吸附核酸，并在磁场的作用下达到分离核酸的作用。
【发明内容】
[0005]本发明致力于开发一种快速、可自动化的大规模提取核酸方法，并提供一种采用磁珠从样本中提取并纯化核酸的试剂盒。该试剂盒操作简便，提取核酸片段完整、纯度高，适用于检测、克隆、序列分析、PCR扩增、分子杂交和测序等下游实验。
[0006]该试剂盒组分如下:提取液I (裂解)、提取液II (结合)、提取液IIK洗涤)、提取液IV (洗涤)、提取液V (洗脱)、磁珠悬浮液、蛋白酶K工作液、核酸助沉剂。
[0007]所述提取液I (裂解)为含表面活性剂的溶液，优选的是2M-5M GuSCN、60-95mMTris-HCl、0.5%-2% Triton X-100、20?10mM EDTA，所述提取液 I 的 pH 值=6-7。
[0008]所述提取液II (结合)优选的是0.6-3 M NaCl、0.6%_3% β -巯基乙醇、50_200mMHEPES。
[0009]所述提取液III (洗涤)优选的是50%-65%乙醇、20-200mM NaCl和20_150mMTris-HCl0
[0010]所述提取液IV (洗涤)优选的是20-200mM Tris-HCl的水溶液。
[0011 ]所述提取液 V (洗脱)含有 10 mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH 值=8.0。
[0012]所述磁珠悬浮液优选的是磁珠含量为30~60mg/ml,磁珠颗粒直径为0.2-1.5 μ m。
[0013]所述蛋白酶K工作液优选的是终浓度为l_20mg/ml。
[0014]所述核酸助沉剂为分子生物学级5-30mg/mlAcryl多聚物溶液。
[0015]上述的磁珠法提取病毒核酸的试剂盒提取方法，其包括以下步骤:
1)在生物样本中加入提取液1、磁珠、蛋白酶K、提取液II，使样本裂解释放出DNA/RNA, DNA/RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离；
2)向磁珠-核酸复合物加入提取液III，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；
3)向磁珠-核酸复合物加入提取液IV，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；
4)向洗涤后的磁珠-核酸复合物加入提取液V，改变磁珠和核酸结合情况，将核酸在磁珠上面洗脱下来，在磁场作用下，磁珠和核酸DNA/RNA溶液分离，得到纯化的核酸DNA/RNA。
[0016]本试剂盒试用样本包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、分泌物、粪便、病毒培养液和其他无细胞体液样本。
[0017]本发明所提取的核酸可直接进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究以及临床检测。
[0018]本试剂盒可用配合自动化仪器，高通量提取病毒核酸。
【附图说明】
[0019]图1为采用本发明的试剂盒提取的中检所国家参考品L0-L7扩增结果。
[0020]图2为采用本发明的试剂盒提取的HCV不同稀释度扩增结果。
【具体实施方式】
[0021]参照一下实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
[0022]血清或血浆液体样本的制备及保存:
1)血清制备:用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30-60分钟,但不超过4小时,血标本可自凝析出血清,或1500rpm离心5_10分钟，吸取上层血清并转移至无菌离心管中；
2)血浆制备:用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管使静脉血与抗凝剂充分混匀，室温放置5-10 min, 1500rpm离心5_10分钟，吸取上层血浆并转移至无菌离心管中。
[0023]制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，4°C保存不超过48小时，_20°C保存不超过半年。运输时需用0°c冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时限不宜超过48小时。
[0024]实施例1:以中检所乙型肝炎(HBV)国家标准品线性灵敏度L0-L7为待测样本，L7为L6 10倍稀释所得，浓度为3-30 IU/ml，用本发明试剂盒以及使用方法对上述样本进行提取并荧光定量PCR检测。
[0025]I)在1.5ml无核酸酶离心管中加入提取液I 300ul，蛋白酶K 60ul，核酸助沉剂4ul，磁珠20ul，国家参考盘各灵敏度参考品200ul、提取液II lOOul，室温放置15min，期间不停地颠倒混匀，使磁珠和核酸充分接触，1500rpm瞬时离心，将离心管置于磁力架2min，使管内磁珠被吸附，用移液器吸走管内液体。2)加入提取液III 550ul，振荡5s，使磁珠悬浮，瞬时离心，将离心管置于磁力架上2min，使管内磁珠被吸附，用移液器吸走管内液体，再重复上述操作I次。3)保持离心管在磁力架上，静置lmin，用移液器吸走管内残液，加入提取液IV 600ul，在磁力架上反复吹打5-6次，磁力架吸附lmin，使管内磁珠被吸附，静置lmin，用移液器吸走管内残液。4)加入50ul提取液V洗脱，吹吸混匀，然后55°C温浴lOmin，期间颠倒混匀4次，将离心管置于磁力架上2min，使管内磁珠被吸附，将液体转移到新的离心管中。
[0026]实施例2:以丙型肝炎(HCV)强阳性血清样本为待测样本，10倍梯度稀释，用本试剂盒以及发明方法对上述样本进行提取并荧光定量PCR检测。
[0027]I)在1.5ml无核酸酶离心管中加入提取液I 300ul，蛋白酶K 60ul，核酸助沉剂4ul，磁珠20ul，含丙肝病毒的血清样本200ul、提取液II 10ul，室温放置15min，期间不停地颠倒混匀，使磁珠和核酸充分接触，1500rpm瞬时离心，将离心管置于磁力架2min，使管内磁珠被吸附，用移液器吸走管内液体。2)加入提取液III 550ul，振荡5s，使磁珠悬浮，瞬时离心，将离心管置于磁力架上2min，使管内磁珠被吸附，用移液器吸走管内液体，再重复上述操作I次。3)保持离心管在磁力架上，静置lmin，用移液器吸走管内残液，加入提取液IV 600ul，在磁力架上反复吹打5-6次，磁力架吸附lmin，使管内磁珠被吸附，静置lmin，用移液器吸走管内残液。4)加入50ul提取液V洗脱，吹吸混匀，然后55°C温浴lOmin，期间颠倒混匀4次，将离心管置于磁力架上2min，使管内磁珠被吸附，将液体转移到新的离心管中。
【主权项】
1.一种磁珠法提取病毒DNA/RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: 在生物样本中加入提取液1、磁珠、蛋白酶K、提取液II，使样本裂解释放出DNA/RNA，DNA/RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离； 向磁珠-核酸复合物加入提取液III，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物； 向磁珠-核酸复合物加入提取液IV，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物； 向洗涤后的磁珠-核酸复合物加入提取液V，改变磁珠和核酸结合情况，将核酸在磁珠上面洗脱下来，在磁场作用下，磁珠和核酸DNA/RNA溶液分离，得到纯化的核酸DNA/RNA。
2.根据权利要求1所述的应用纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于，试剂盒组分包括提取液I (裂解)、提取液II (结合)、提取液IIK洗涤)、提取液IV (洗涤)、提取液V (洗脱)、磁珠悬浮液、蛋白酶K工作液、核酸助沉剂； 所述提取液 I (裂解)含有 2M-5M GuSCN、60-95mM Tris-HCl、0.5%_2% Triton X-100、20~100mM EDTA ； 所述所述提取液II (结合)是0.6-3 M NaCU0.6%_3% β -巯基乙醇、50_200mM HEPES ； 所述提取液IIK洗涤)含有 50%-65% 乙醇、20-200mM NaCl 和 20_150mM Tris-HCl ； 所述提取液IV (洗涤)为20-200mM Tris-HCl的水溶液； 所述提取液 V (洗脱)含有 1mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH 值=8.0 ; 所述磁珠悬浮液为磁珠含量为30-60mg/ml，磁珠颗粒直径为0.2-1.5ym； 所述蛋白酶K工作液终浓度为l-20mg/ml ； 所述核酸助沉剂为分子生物学级5-30mg/mlAcryl多聚物溶液。
3.根据权利要求书2试剂盒组分，其特征在于，提取液I(裂解)PH值=6-7。
4.根据权利要求书1、2所述的应用纳米磁珠提取病毒核酸的试剂盒，其特征在于，可提取生物样品包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、分泌物、粪便、病毒培养液和其他无细胞体液样本。
5.根据权利要求书2所述的磁珠悬浮液，其特征在于，纳米磁珠表面具有核壳结构，即超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠,磁珠粒径为0.2-1.5 μ m。
【专利摘要】本发明公开了一种利用磁珠提取病毒DNA/RNA的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括提取液Ⅰ（裂解）、提取液Ⅱ（结合）、提取液Ⅲ（洗涤）、提取液Ⅳ（洗涤）、提取液Ⅴ（洗脱）、磁珠悬浮液、蛋白酶K工作液、核酸助沉剂 8种组分，试剂盒提取方法包括以下步骤：裂解结合、洗涤、洗脱。本试剂以及提取方法可以用于不同类型样本的病毒DNA/RNA提取，高效去除样本中的蛋白质、脂类等杂质，提取的核酸纯度高、片段完整，提取过程安全无毒。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104673783
【申请号】CN201510023368
【发明人】郭冬冬, 迟磊, 杨海侠, 张琳, 吕翔
【申请人】宝瑞源生物技术(北京)有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年1月19日