一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物育种技术领域，更具体地说，是涉及木质素降解菌糙皮侧耳和 酿酒酵母原生质体的融合方法。
【背景技术】
[0002] 木质素是构成植物细胞壁的主要成分，是影响动物消化植物性饲料的关键所在。 白腐真菌是迄今发现降解木质素最有效的微生物，也是经常用于木质素降解研究的模式菌 株。但在自然状态下，由于白腐真菌的定植缓慢，很难形成优势种群，其要求的发酵条件较 严格，目前大多数的研究还仅限于实验室的小试阶段。糙皮侧耳作为一种白腐真菌，除具有 食用和药用价值外，还具有很强的木质素和纤维素的降解能力，在生物处理过程中能产生 并积累大量的微生物菌体蛋白及其他有用代谢产物，如：有机酸醇、酯、维生素和微量元素 等使饲料变软变香，并含有多种消化酶，多种未知的促生长因子，能增强动物的抗病能力， 刺激其生长发育。有些代谢产物对饲料还具有防腐作用（乳酸和乙醇等)，能延长饲料的保 质期。酿酒酵母其生长速度快，代谢产物有丰富的优质蛋白、B族维生素和矿物质。基于细 胞融合技术原理，将糙皮侧耳和酿酒酵母作为二亲本，对糙皮侧耳原生质体和酿酒酵母原 生质体进行化学和电融合，构建出兼具两亲本的优良特性，可有效降解植物性饲料中的木 质素，改善高木质素含量粗饲料的营养结构的新菌株。糙皮侧耳属真菌界，担子菌门，伞菌 亚门，伞菌纲，伞菌亚纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属。酿酒酵母属真菌界，子囊菌门，半子囊菌 纲，酵母目，酵母科，酵母属。糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体融合属于门间融合，查阅资料 国内外尚无糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体融合育种报道。
【发明内容】
[0003] 本发明公开了一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法，其特征在于按如下 的步骤进行： (1) 分别制备出糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体，然后对糙皮侧耳原生质体进行60°C 水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活率达到100%;酿酒酵母原生质体在距离15W紫 外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒酵母原生质体灭活率达到100% ; (2) 将两亲本原生质体溶液浓度调至105个/mL，分别取双亲原生质体各0. 5 mL以重 量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min,弃上层液，得原生质体后加入鹿糖渗稳剂1 mL 和浓度为 30%-45%PEG4000- (0.02 -0.08mol/L )CaCl2 1 mL，调整 pH5-pHll;所述的蔗 糖渗稳剂指的是〇. 6 mol /L蔗糖溶液。
[0004] (3)将上述原生质体混匀后迅速置于恒温水浴中，在20-35°C条件下进行5-30 min 的化学融合，不同时间取样4000 r/min离心10 min,弃上清液；再用鹿糖渗稳剂洗漆2次， 去除PEG4000,将得到的原生质体沉淀用蔗糖渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于 固体再生培养基(葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/ L、麦麸(浸提液）15 g/L、蔗糖15 g/L、KH2 P04 1. 5 g/L、MgS04 7H2 0 0? 05 g /L 和维生素 B1 4 mg /L，琼脂 20 g/L，硫酸镁 0.6 mol/L)上，置于27°C恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，观察记录菌落生长情况并计数，计 算融合率； (4)将两亲本原生质体溶液浓度调至107个/mL，分别取双亲原生质体各0. 5 mL以重 量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min,弃上层液，得原生质体后加入PM缓冲液，洗 涤2次，定容lmL，用无菌液枪将50-200 yl的原生质体混合液加入CRY-3型电融合仪的融 合小室，打开融合仪电源，调节交变电压20-50 V、交变电场频率800-1100 kHz、脉冲场强 4-7kV / cm、脉冲个数3-6个及脉冲间隔10-80uS到所需位置，时隔30s先后按下成串脉冲、 融合脉冲和脉冲触发开关，30s后将小室内溶液吸出并用0.6 mol /L甘露醇稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基(蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、琼 月旨20 g/L、山梨醇0.6 mol/L)上，置于27°C恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，定期观察 记录菌落生长情况并计数，计算融合率； 所述的PM缓冲液指的是：甘露醇和氯化钙配成0. 6 mol /L质量浓度溶液。
[0005] 本发明采用常规方法制备出糙皮侧耳(涂苑楠，范寰等，糙皮侧耳的原生质体制 备和再生条件的研究[J].饲料研究，2013,4 :29-31，56.)和酿酒酵母的原生质体(马恒 德，郭成金.啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选[J].中国酿造，2012,31 (2): 140-144.)后，对糙皮侧耳原生质体进行60°C水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活 率达到100% ;酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒 酵母原生质体灭活率达到100%，再通过L 16 (45)正交试验设计获得糙皮侧耳和酿酒酵母的 化学融合方法：PEG 4000浓度为30-45%与0.02-0. 08 mol/L Ca2+的混合溶液（pH5-pHll) 作为促融剂，在20-35°C条件下融合5-30 min，融合率达到1.046 -26. 09 X 10_4,共获 得183株再生菌株，经颉颃鉴定试验、菌丝形态学比较和随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)分子鉴定，得到 14 个融合株，分别为 A、B、C、D、G、I、 L、M、N、0、P、X、Y、Z。
[0006] 颉颃鉴定试验 如图1显示，14株疑似融合株与亲本间均存在明显的颉颃现象，其中菌株A、C、L、N、0、 Y与亲本对峙生长，颉颃线处有沟；〇、6、1^、？与亲本对峙生长，颉颃线处形成脊出越过颉 颃线覆盖亲本；X、Z则是被亲本覆盖；B、D在颉颃线处有褐色液体分泌。菌丝形态学比较结 果显示(见表1和图2)，融合株菌丝体均与糙皮侧耳相似。
[0007] 表1亲本与融合株菌丝形态比较结果
【主权项】
1. 一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 分别制备出糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体，然后对糙皮侧耳原生质体进行60°C 水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活率达到100%;酿酒酵母原生质体在距离15W紫 外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒酵母原生质体灭活率达到100% ; (2) 将两亲本原生质体溶液浓度调至105个/mL，分别取双亲原生质体各0. 5 mL以重 量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min,弃上层液，得原生质体后加入鹿糖渗稳剂1 mL 和浓度为 30%-45%PEG4000-CaCl2 (0.02 -0.08mol/L)l mL，调整 pH5-pHll;所述的蔗糖 渗稳剂指的是〇. 6 mol /L蔗糖溶液； (3) 将上述原生质体混匀后迅速置于恒温水浴中，在20-35°C条件下进行5-30 min的 化学融合，不同时间取样4000 r/min离心10 min,弃上清液；再用鹿糖渗稳剂洗漆2次，去 除PEG4000,将得到的原生质体沉淀用蔗糖渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固 体再生培养基(葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/ L、麦麸(浸提液)15 g/L、蔗糖15 g/L、KH2 P04 1. 5 g/L、MgS04 7H2 0 0? 05 g /L、维生素 B1 4 mg /L、琼脂 20 g/L、硫酸镁 0.6 mol/ L)上，置于27°C恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，观察记录菌落生长情况并计数，计算融 合率；或 (4) 将两亲本原生质体溶液浓度调至107个/mL，分别取双亲原生质体各0. 5 mL以重 量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min,弃上层液，得原生质体后加入PM缓冲液，洗 涤2次，定容lmL，用无菌液枪将50-200 yl的原生质体混合液加入CRY-3型电融合仪的融 合小室，打开融合仪电源，调节交变电压20-50 V、交变电场频率800-1100 kHz、脉冲场强 4-7kV / cm、脉冲个数3-6个及脉冲间隔10-80uS到所需位置，时隔30s先后按下成串脉冲、 融合脉冲和脉冲触发开关，30s后将小室内溶液吸出并用0.6 mol /L甘露醇溶液，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基(蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、琼 月旨20 g/L、山梨醇0.6 mol/L)上，置于27°C恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，定期观察 记录菌落生长情况并计数，计算融合率； 所述的PM缓冲液指的是：甘露醇和氯化钙配成0. 6 mol /L质量浓度溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的融合方法，是将糙皮侧耳和酿酒酵母制备出的原生质体，然后对糙皮侧耳原生质体进行60℃水浴处理10 min热灭活，酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，采用化学融合和电融合。最后从17个融合子中，通过生长速度和木质素降解率的比较，获得了6株生产速度比亲本糙皮侧耳提高1.45-16.33%左右，木质素降解率提高1.76-4.16倍的融合子。本发明可以将糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合。该技术可重复性较强，遗传稳定性好且方法简便属于非转基因育种方式，没有创造新基因，不存在基因污染问题。
【IPC分类】C12N15-08, C12R1-865, C12R1-645, C12N15-04
【公开号】CN104673780
【申请号】CN201510151684
【发明人】范寰, 刘西周, 郭成金, 燕晓翠, 涂苑楠, 孟繁瑞, 马蕊, 马恒德
【申请人】天津市畜牧兽医研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年4月2日