一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种基于磁珠法的全血DNA提取试剂盒，可应用 于多个物种全血DNA提取。本发明还设及应用该试剂盒从全血样本中提取DNA的方法。
【背景技术】 阳00引基因组DNA中含有细胞中全部的遗传信息，从全血中提取DNA是获得生物基因组DNA较为简单的方法，也是进行基因相关性研究的重要手段盒技术。DNA提取的质量盒产量 直接影响着后续实验的准确性。
[0003] 目前有多种全血DNA提取试剂盒可应用于多种领域，但传统的提取技术需要进行 沉淀、离屯、等操作，并需要大量的生物样本，导致使用当前的全血DNA提取试剂盒进行提取 存在诸多缺点，如提取过程复杂、样本处理时间长、样本处理丢失大量DNA、提取步骤易错、 易造成样本交叉污染、需多种仪器等。
[0004] 磁珠法属于固相抽提法，是采用磁珠为载体的分离技术。由于磁珠法提取核算 操作简单，快速，重复性好，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和 RNA，可应用在疾病控制中屯、、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品 安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。相比传统的DNA提取方法，磁珠法无需 离屯、和大量检材，也无需接触酪/氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化操 作，基于磁珠法的核酸提取具备传统DNA提取无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重 要方向。为更有效的配合磁珠法使用，需要研发适用于磁珠法的新型全血DNA提取试剂盒。
【发明内容】
[00化]本发明的目的在于克服上述现有全血基因组DNA提取试剂盒的缺陷，提供一种基 于磁珠法的全血DNA提取试剂盒及其应用，该试剂盒具有操作简单快速、使用安全、提取效 率高、制造成本低的优点，提取得到的高浓度、搞纯度DNA可供科研和临床检测之用。为了 实现上述技术目的，本发明试剂盒的技术方案为： 本发明提供一种全血基因组DNA提取的试剂盒，所述试剂盒中的试剂包括细胞裂解 液、结合液、洗涂液和核酸洗脱液，所述洗涂液包括洗涂液I和洗涂液II;所述细胞裂解液 含有盐酸脈、乙二胺四乙酸、Ξ径甲基氨基甲烧、氯化钢和曲拉通X-100 ;所述结合液含有 聚乙二醇-8000和氯化钢；所述洗涂液包括洗涂液I和洗涂液II，其中：所述洗涂液I含有 盐酸脈、乙二胺四乙酸、Ξ径甲基氨基甲烧、氯化钢和乙醇；所述洗涂液II含有乙醇；所述 核酸洗脱液含有乙二胺四乙酸和Ξ径甲基氨基甲烧。
[0006] 优选地，在所述细胞裂解液中，盐酸脈的浓度为2-lOmol/L，乙二胺四乙酸的浓度 为5-20mmol/l，S径甲基氨基甲烧的浓度为2〇-8〇111111〇1/1，氯化钢的浓度为100-500mmol/ L曲拉通X-100的浓度为1%-5% (v/v)，余量皆为去离子水；使用氨氧化钢和盐酸调节所述 细胞裂解液的抑值为7. 0-9. 0。更为优选地，所述盐酸脈的浓度为6mol/l，所述乙二胺四 乙酸的浓度为lOmmol/l，所述Ξ径甲基氨基甲烧的浓度为50mmol/l、所述氯化钢的浓度为 200mmol/l，所述曲拉通X-100的浓度为4% (v/v)，细胞裂解液的抑值调节为8. 0。
[0007] 优选地，在所述结合液中，聚乙二醇-8000的浓度为40-50mmol/l，氯化钢的浓度 为5mol/L。更为优选地，所述聚乙二醇-8000的浓度为50mmol/L。
[0008] 优选地，在所述洗涂液I中，盐酸脈的浓度为2-lOmol/l，乙二胺四乙酸的浓度为 5-20mmol/l，S径甲基氨基甲烧的浓度为2〇-8〇111111〇1/1，氯化钢的浓度为100-500mmol/l， 乙醇的体积比浓度为50%-70%，余量皆为去离子水；使用氨氧化钢和盐酸调节所述洗涂液 I的抑值为7. 0-9. 0。更为优选地，所述盐酸脈的浓度为6mol/l，所述乙二胺四乙酸的浓 度为lOmmol/l，所述Ξ径甲基氨基甲烧的浓度为50mmol/l，所述氯化钢的浓度为200mmol/ L，所述乙醇的浓度为50% (v/v)，洗涂液I的抑值调节为8. 0。
[0009] 优选地，在所述洗涂液II中，乙醇的浓度为50%-100% (v/v)。更为优选地，所述乙 醇的浓度为75% (v/v)。
[0010] 优选地，在所述核酸洗脱液中，Ξ径甲基氨基甲烧的浓度为5-15mmol/l，乙二胺四 乙酸的浓度为1. 0-1. 5mmol/L。更为优选地，所述Ξ径甲基氨基甲烧的浓度为8111111〇1/1，所 述乙二胺四乙酸的浓度为1. 3mmol/L。
[0011] 本发明还提供两种上述试剂盒的应用方法，方法一的技术方案为，包括如下步 骤： ① 在EP管中加入抗凝全血、细胞裂解液和蛋白酶K，56°C水浴解育30分钟； ② 再加入磁珠、结合液和无水乙醇，结合时间10分钟； ③ 使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去EP管内所有液体； ④ 在EP管中加入洗涂液I，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体； ⑥在EP管中加入洗涂液II，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体， 该步骤重复一次； ⑧在EP管中加入核酸洗脱液，于65°C水浴下洗脱5分钟，使用磁铁将磁珠吸附至管壁， 将洗脱液转移至新的EP管内，-20°C保存备用； 其中：步骤①中加入的裂解液与全血的体积比为1:1-1:5 ;步骤②中加入的磁珠与结 合液的体积比为1:10-1:20 ;步骤④与步骤⑥中加入的洗涂液I和洗涂液II分别与裂解液 的体积比为5:1-10:1 ;步骤⑧中核酸洗脱液与细胞裂解液的体积比为1:1-1:5。
[0012] 优选地，所述EP管容量为加入的试剂为：10μL浓度lOmg/mL的蛋白酶K，抗 凝全血100μ以细胞裂解液200μ以磁珠20μ以结合液100μ以无水乙醇300μ以洗涂液I 和洗涂液II各600μ以核酸洗脱液100μL。
[0013] 方法二的技术方案为，包括如下步骤： ① 96孔反应板1排和7排加入细胞裂解液、蛋白酶Κ、结合液和无水乙醇； ② 所述96孔反应板2排和8排加入磁珠和去离子水； ③ 所述96孔反应板3排和9排加入洗涂液I; ④ 所述96孔反应板4-5排和10-11排加入洗涂液II; ⑥所述96孔反应板6排和12排加入核酸洗脱液； ⑧所述96孔反应板1排和7排加入全血，运行核酸提取仪，结束后将96孔反应板6排 和12排中的核酸洗脱液转移至新的ΕΡ管内，-20°C保存备用； 其中：所述96孔反应板单孔内的液体总体积小于1.OmL;步骤①中加入的细胞裂解液 为200μk300μL，结合液为50-100μL，无水乙醇的体积为200-400μL;步骤②中加入的 磁珠为20-100μ以且用300-600μL去离子水与其混匀；步骤③与步骤④中加入的洗涂液 I和洗涂液II分别为500μ心700μL;步骤⑥中加入的核酸洗脱液为50-300μL。更为优选 地，细胞裂解液、结合液、无水乙醇的体积比为2:1:3,两种洗涂液与细胞裂解液的体积比均 为3:1，核酸洗脱液与细胞裂解液的体积比为1:4,细胞裂解液与全血的体积比为2:1。因 96孔反应板为8X12孔，当所述96孔反应板使用1排至12排时，使用核酸提取仪最多可一 次性处理16个全血样本。
[0014] 优选地，加入的试剂为：10μL浓度lOmg/mL的蛋白酶Κ，全血100 细胞裂解液 200μ以磁珠20μL和去离子水600μ以结合液100μ以洗涂液I和洗涂液II各600μ以核 酸洗脱液50μL。
[0015] 本发明技术方案中，待提取的全血无需进行预处理，细胞裂解液直接与全血混合 裂解全血中的所有细胞，再利用磁珠法对裂解出的核酸进行纯化。本发明试剂盒可应用于 多个物种全血DNA的提取，包括人类、晒齿类、鸟类等多种生物；提取过程既可W手工完成， 也可W应用于全自动核酸提取仪自动完成；使用本发明试剂盒提取的全血DNA可应用于 PCR扩增、基因突变筛查、基因分型、基因测序等科研或法医鉴定或临床诊断的分析。
[0016] 与传统的全血DNA提取技术相比，本发明技术方案的有益效果为： 1. 无需对全血进行预处理，直接将全血与细胞裂解液混合并裂解全血中的所有细胞， 大大节省了全血基因组DNA提取的时间； 2. 结合液使得磁珠发挥更大的核酸结合能力，尽可能多的吸附血细胞释放的核酸，从 而可获取高浓度的核酸溶液； 3. 使用两种洗涂液可W洗去全血样本中绝大部分的蛋白、酪类、多糖等杂质，最大限度 的减少杂质的污染，从而获得更高纯度的核酸溶液； 4. 使用本发明的技术方案提取全血DNA，可有效的减少提取过程中核酸的损失，大大增 加提取效率，且提取过程中不使用有毒试剂和有机溶剂，可大幅降低对实验人员的身体伤 害； 5. 本发明试剂盒应用于核酸提取仪，可一步完成全血DNA的提取，并可同时进行1-16 个全血样本的DNA提取，实现核酸提取的自动化。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例2中使用方法一提取的人类全血基因组DNA的琼脂糖凝胶电 泳条带； 图2为本发明实施例3中使用方法二提取过程中使用的96孔反应板立体图； 图3为图2所示96孔反应板在方法二提取过程中各排注入试剂的示意图； 图4为本发明实施例3中使用方法二提取的人类全血基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳条 带。
【具体实施方式】
[0018] W下结合附图通过实施例对本发明做进一步说明，W便更好地理解本发明。
[0019] 实施例1 :全血基因组DNA提取试剂盒中试剂的配制 (1) 细胞裂解液的配制：先在容量瓶中加入少量去离子水，加入浓度为6mol/L的盐酸 脈、加入浓度为lOmmol/L的乙二胺四乙酸、加入浓度为50mmol/L的Ξ径甲基氨基甲烧、加 入浓度为200mmol/L的氯化钢、加入浓度为4% (v/v)的曲拉通X-100,加入去离子水至所需 体积，使用氨氧化钢和盐酸调节抑值，使所述细胞裂解液的抑值为8. 0,高压蒸汽灭菌10 分钟； (2) 结合液的配制：先在容量瓶中加入少量去离子水，加入浓度为50mmol/L的聚乙二 醇-8000,浓度为5mol/L的氯化钢，加入去离子水至所需体积，高压蒸汽灭菌10分钟； (3)洗涂液I的配制：加入浓度为6mol/L的盐酸脈、加入浓度为lOmmol/L的乙二胺四 乙酸、加入浓度为50mmol/L的Ξ径甲基氨基甲烧、加入浓度为200mmol/L的氯化钢，加入去 离子水至所需体积，使用氨氧化钢和盐酸调节抑值，使所述洗涂液I的抑值为8.0,高压蒸 汽灭菌10分钟； (4) 洗涂液II的配制：采用75%乙醇； (5) 核酸洗脱液的配制：加入浓度为8mmol/L的Ξ径甲基氨基甲烧，加入浓度为 1. 3mmol/L的乙二胺四乙酸，加入去离子水至所需体积，高压蒸汽灭菌10分钟； 除上