一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明涉及一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途，该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶联到磁珠上，然后用抗乳铁蛋白的抗体与磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶联，然后再利用交联剂对结合乳铁蛋白抗体的蛋白G/蛋白A磁珠进行交联，该免疫制备方法充分利用了蛋白G与蛋白A与抗体亲和力高以及与抗体的Fc片段特异性结合的特点。主要用于对于粮食、食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的乳铁蛋白的结合和纯化。可以用于乳铁蛋白检测前样品前期处理，样品中乳铁蛋白检测以及乳铁蛋白纯化。
【专利说明】
一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种乳铁蛋白的定向免疫磁珠及其制备方法和用途。该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A与磁珠共价偶联，然后将乳铁蛋白抗体连接到蛋白G或者蛋白A上，再采用交联剂进行交联，制备成稳定的乳铁蛋白定向免疫磁珠。该磁珠具有特异性强，乳铁蛋白纯化效率高和使用简便的特点。属食品药品生产和检测领域。
【背景技术】
[0002]乳铁蛋白(Lacoferrin)是一种相对分子质量约为80KD的糖蛋白，主要存在于乳中，特别在初乳中可达7g/L。不管是人乳还是牛乳，随着乳汁的成熟，其含量会有所下降。除了作为乳腺组织分泌的非特异性保护蛋白质外，乳铁蛋白还存在于其他外分泌物中，如泪、汗、唾液、胆汁、胰液和小肠腺液等中。
[0003]乳铁蛋白是一种天然的抗菌糖蛋白，乳铁蛋白的特异性的铁离子结合能力使其对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抗菌能力。研究证明，天然的乳铁蛋白具有抗病毒能力，日本国立癌症中心研究所和京都大学病毒研究所的科研人员经过动物实验和临床试验实验发现乳铁蛋白能够抑制人的免疫缺陷病毒和巨细胞病毒对M几细胞和成纤维细胞的病变作用。除此之外，天然的乳铁蛋白还具有抑制流感病毒的活性。乳铁蛋白还具有抗氧化作用和免疫调节作用。因此，乳铁蛋白被用于食品和药品等多种领域。
[0004]新生儿的免疫系统约在一岁左右才可以发育成熟，所以他们对病菌的抵抗力比较弱，在婴幼儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，可以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现状，还可以制成含铁或补铁胶囊，以用来提高婴幼儿及孕妇的造血功能，帮助婴幼儿构筑起生命的第一道防线。
[0005]针对很多由病毒所引发的疾病，提高人体自身的免疫力是最好的治疗方法，在临床上一般多采取强化免疫力的支持性间接治疗的方法，在治疗中补充乳铁蛋白，能够增强人体的免疫力，预防病毒性感冒、肠道感染等疾病的发生。美国食品药品管理局(FDA)允许将乳铁蛋白作为食品添加剂应用于运动、功能性食品中，在日本、韩国也允许将乳铁蛋白作为食品添加剂应用于食品中。在我国，卫生部在国家标准《食品添加剂使用卫生标准GB2760 一 19966》2004年增补品种中允许在婴儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，添加量允许范围为 0.30mg/g — lmg/go
[0006]目前，国内外对乳铁蛋白分离方法的研究比较多，主要有盐析法、超滤法、色谱法坐寸ο
[0007]超滤法纯化乳铁蛋白，原理是利用不同孔径的超滤膜，将待分离的样本进行过滤，分子大小超过改孔径的就会被截留而小于该孔径的分子就会被滤掉。超滤法操作简单，费用相对较低，相对而言比较容易形成工业化的生产规模。它的缺点是得到的乳铁蛋白的纯度较低，超滤膜需要经常清洗。超滤法只能制备粗提的乳铁蛋白制品。不能够得到高纯度的乳铁蛋白。
[0008]盐析法纯化乳铁蛋白，是利用高浓度的盐离子使蛋白表面的离子饱和，从而降低其离子间作用使蛋白沉淀。盐析法所需试剂简单廉价，且操作比较简单，成本相对而言要低很多，但是盐析法分离纯化得到的乳铁蛋白的纯度不是很高，适用于保健品和食品添加剂等对乳铁蛋白的纯度要求不高的行业。
[0009]色谱法也叫层析法，是利用固定基质和吸附质间物理或化学吸附强度的不同来分离物质的一种方法，疏水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分离上有重要的应用，其缺点是吸附容量比较小，效率比较低。
[0010]离子交换层析是层析法的一种，最早利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯化得到较纯的乳铁蛋白的是Groves尔后他又开发出了磷酸纤维素交换色谱法Foley等人(岛崎敬一黑田青隆.酪农科学，食品与研究，1989,38:95)在此法的基础上加以改进，分离得到的乳铁蛋白的纯度在81%左右。中国专利CN101724013.A公布了一种从牛乳中分离纯化乳铁蛋白的方法就是通过阳离子交换层析与阴离子交换层析结合来得到纯度较高的乳铁蛋白。此外中国专利CN1849903A、CN1663961A和CN101117351A等是通过离子交换层析或者离子交换层析与膜分离技术相结合从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白。此外，美国专利US5149647利用微滤处理与阳离子交换树脂结合乳清中纯化乳铁蛋白。总体来说，离子交换层析能够处理大量的乳品样本，并且成本低廉。缺点就是操作比较繁琐，而且往往得到的乳铁蛋白纯度受到限制。
[0011]亲和层析法是一种比较新兴的分离技术，利用配体和乳铁蛋白的亲和力进行分离纯化。它的一般结构为:不容基质一连接物一隔离臂一连接物一配体。基质一般多用琼脂多糖，隔离臂一般多是有一定长度的可以连接基质的有机物如NH2-(CH2)n-NH2 (n=6_ll)等。肝素琼脂糖亲和色谱是目前被认为纯化乳铁蛋白最好的亲和色谱。它能从乳中一步分离来得到乳铁蛋白，经电泳分析表明其纯度很高，可以达到90%以上。中国专利CN1486989A描述了一种肝素琼脂糖亲和柱层析纯化乳铁蛋白的方法。此类亲和柱可以简单的一步纯化得到纯度较高的乳铁蛋白，亲和柱由于其固有的塔板效应的缺点，在纯化时上层的凝胶与乳铁蛋白较好，但由于凝胶空隙被堵塞的影响，越到柱子的底部与蛋白结合越弱。致使亲和层析柱用于大规模的纯化时不能充分发挥其性能。
[0012]磁珠法的原理类似于亲和层析，将亲和介质通过化学键偶联到磁珠上。在纯化时将磁珠与原料混合，使配体与亲和物发生反应。利用磁珠能够与磁铁结合的特性使磁珠贴壁然后将杂物分离掉。中国专利CN103406101报道了一种利用染料磁珠纯化乳铁蛋白的方法。但相对来说染料与乳铁蛋白的结合能力远远比不上抗原抗体的结合能力与特异性。
[0013]目前市场上常见的定向免疫磁珠都是将抗体直接偶联到磁珠表面，但是由于抗体分子较大，偶联不受控制，抗体可能以任何方向偶联到磁珠上。某些抗体偶联方向会导致在抗原分子结合时由于空间位阻的原因无法结合，更有些情况下，抗体的抗原结合区域偶联到磁珠上导致这一抗原结合区域被封闭掉。由于乳铁蛋白分子很小，携带的抗原表位只有1-2个，一个抗原结合区域的封闭就可能导致这一分子的抗体失去抗原结合能力。因而会影响到整个定向免疫磁珠的抗原结合效率。
【发明内容】
[0014]本发明的目的在于提供一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途，在本发明中，我们利用了抗原抗体特异性结合的原理，将乳铁蛋白抗体通过定向偶联，连接到磁珠上，用于纯化样本中的乳铁蛋白。如果利用乳铁蛋白的定向免疫磁珠对样本中的乳铁蛋白进行纯化，只需要将样本与磁珠混合，磁珠上面的抗体就可以将样本中的乳铁蛋白吸附，磁珠利用磁性原理贴壁后，将其余的部分去除，然后再将结合在定向免疫磁珠上面的乳铁蛋白洗脱下来。不但操作简单，而且还可以对样本中的乳铁蛋白进行富集，可以检测低含量的样本。此外，由于完全在液相条件下进行乳铁蛋白纯化，每个磁珠对于乳铁蛋白的结合能力都是相同的，因而纯化效率很高。利用蛋白A或者蛋白G能够特异性结合抗体恒定区(Fe区)的特点，通过蛋白A或者蛋白G将抗体固定在磁珠表面，使得抗体的抗原结合区域(Fab区)全部暴露在外，大大增加了定向免疫磁珠的抗原结合能力。
[0015]为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G或者蛋白A的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fe部位相结合。并且具有很高的亲和力。蛋白A是葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，与蛋白G类似。蛋白A也具有抗体结合能力，也是通过抗体的Fe区域与抗体结合。微生物来源的蛋白G和蛋白A这一特性与其多年来进化获得的宿主逃避和自我保护能力密切相关。我们克隆了野生蛋白G和蛋白A的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G和蛋白A。将基因重组的蛋白G或蛋白A偶联到磁珠上后，再将乳铁蛋白抗体偶联到蛋白G或蛋白A上，制备出了乳铁蛋白一蛋白G/蛋白A—磁珠，再用交联剂将载体进行交联。就形成了高亲和力的乳铁蛋白定向免疫磁珠。该磁珠操作简便，纯化乳铁蛋白效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的乳铁蛋白，用于高效液相色谱检测。
[0016]具体操作如下:
本发明最大的优势就是利用了蛋白G与蛋白A与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fe区，其中，Fab区是抗原结合的区域。
[0017]蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fe区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，I个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。
[0018]与蛋白G类似，蛋白A是葡萄球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fe区域有特异性的结合能力。蛋白A与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白A，I个分子的蛋白G可以结合6个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。
[0019]以此蛋白G或者蛋白A为基础制备的定向免疫磁珠具有特异性好,乳铁蛋白结合量大，纯化效率高的特点。
[0020]乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法说明如下:
1.将磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起。
[0021]2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC)至终浓度5_20mg/ml，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (Sulfo-NHS)至终浓度10_25mg/ml。
[0022]3.室温反应15-60分钟。
[0023]4.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mM PH6.0的MES缓冲液中。
[0024]5.将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到 5-10:1。
[0025]6.室温反应2-4小时。
[0026]7.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液PH6.0洗涤3次。
[0027]8.反应后的磁珠用IM的乙醇胺室温封闭。
[0028]9.磁珠用20mM PBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中。
[0029]10.在磁珠中加入抗乳铁蛋白抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1.11.将加入抗体的磁珠在37°C反应10-40分钟.12.磁珠用0.1 M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在IM PH9.0的硼酸缓冲液中。
[0030]13.将乳铁蛋白抗体一蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室温反应1_2小时。
[0031]14.用50mM PH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗涤乳铁蛋白抗体一蛋白G/蛋白A —磁珠3次。
[0032]15.将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4中。放于4°C保存。
[0033]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
1.充分的利用了蛋白G与蛋白A与IgG抗体特异性结合的特性，使抗体通过蛋白G/蛋白A偶联到载体上。并且IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了乳铁蛋白的捕捉能力，乳铁蛋白的纯化效率也得到有效提闻。
[0034]2.本发明使用了基因改造后的蛋白G和蛋白A，通过对密码子的优化和IgG结合域基因的优化。使蛋白G和蛋白A的抗体结合能力大幅度提闻，进而提闻了乳铁蛋白的纯化效率。
[0035]3.使用本发明纯化乳铁蛋白操作简便，更方便操作者使用。
[0036]4.使用本发明得到的乳铁蛋白纯度高，可直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测，节省了操作时间和费用。
【附图说明】
[0037]图1、蛋白G偶联的乳铁蛋白定向免疫磁珠结构示意图。
[0038]图2:奶粉样本中乳铁蛋白含量检测HPLC图谱。
[0039]其中，A:磁珠，B:蛋白G, C:乳铁蛋白抗体。
实施例
[0040]实施例1:利用基因重组蛋白G制备乳铁蛋白定向免疫磁珠本发明制备乳铁蛋白定向免疫磁珠的一个优选的实施方案如下:
1.磁珠活化
取5mg羧基修饰的纳米磁珠，用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES缓冲液洗涤3次，然后将磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起。
[0041]2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC) lOOmg，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (Sulfo-NHS) 10mg,室温反应15分钟。
[0042]3.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在5ml 50mMPH6.0的MES缓冲液中。
[0043]4.在磁珠中加入20mg蛋白G，室温反应4小时。
[0044]5.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液PH6.0洗涤3次。
[0045]6.反应后的磁珠用20ml IM的乙醇胺室温封闭2小时。
[0046]7.磁珠用50ml 20mM PBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在5ml 20mM PBSPH7.4缓冲液中。
[0047]8.在磁珠中加入200mg抗乳铁蛋白抗体，将加入抗体的磁珠在37°C反应30分钟。
[0048]9.磁珠用20mM PBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中。
[0049]10.磁珠用0.1M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在5ml 0.1M硼PH9.0的硼酸缓冲液中。
[0050]11.称取26mg 二甲基庚二酸酯(DMP)加入含乳铁蛋白抗体一蛋白G—磁珠的PBS缓冲液中，然后加入10ul 2M的三乙醇胺至调PH8.3.室温反应I小时。
[0051]12.用25ml 50mM PH9.0的乙醇胺终止反应。
[0052]13.用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗涤乳铁蛋白抗体一蛋白G —磁珠3次。然后将磁珠重悬在5ml的该缓冲液中，放于4°C保存。
[0053]实施例2:利用基因重组蛋白A制备乳铁蛋白定向免疫磁珠本发明制备乳铁蛋白定向免疫磁珠的一个优选的实施方案如下:
1.磁珠活化。
[0054]2.取5mg羧基修饰的纳米磁珠，用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES缓冲液洗涤3次，然后将磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起。
[0055]3.在磁珠中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC) lOOmg，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (Sulfo-NHS) 10mg,室温反应20分钟。
[0056]4.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在5ml 50mMPH6.0的MES缓冲液中。
[0057]5.在磁珠中加入30mg蛋白A,室温反应4小时。
[0058]6.反应后的磁珠用50mM MES缓冲液PH6.0洗涤3次。
[0059]7.反应后的磁珠用20ml IM的乙醇胺室温封闭2小时。
[0060]8.磁珠用50ml 20mM PBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在5ml 20mM PBSPH7.4缓冲液中。
[0061]9.在磁珠中加入300mg抗乳铁蛋白抗体，将加入抗体的磁珠在37°C反应30分钟。
[0062]10.磁珠用20mM PBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中。
[0063]11.磁珠用0.1 M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在5ml 0.1 M硼PH9.0的硼酸缓冲液中。
[0064]12.称取26mg 二甲基庚二酸酯(DMP)加入含乳铁蛋白抗体一蛋白A—磁珠的PBS缓冲液中，然后加入10ul 2M的三乙醇胺至调PH8.3.室温反应I小时。
[0065]13.用25ml 50mM PH9.0的乙醇胺终止反应。
[0066]14.用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗涤乳铁蛋白抗体一蛋白A —磁珠3次。然后将磁珠重悬在5ml的该缓冲液中，放于4°C保存。
[0067]实施例3:利用蛋白G偶联的乳铁蛋白定向免疫磁珠纯化脱脂奶粉中的乳铁蛋白
1.取1g脱脂奶粉加入50mL20mM PH7.4 PBS缓冲液溶液混匀；
2.在奶粉溶液中加入IMHCl调节至PH值4.6使酪蛋白沉淀。
[0068]3.4°C条件下12000r离心离心20分钟，取上清。
[0069]4.加入 IM NaOH 调节 PH 至 7.4。
[0070]5.加入lmg/ml蛋白G偶联的乳铁蛋白定向免疫磁珠1ml,混勻后室温放置30分钟。
[0071]6.将反应后的磁珠混合液放到磁力架上2分钟，待磁珠贴壁。用吸管去掉其余的缓冲液。
[0072]7.在磁珠中加入50ml 20mM PH7.4 PBS洗涤磁珠，然后将磁珠放入磁力架中待磁珠贴壁后，用吸管去除缓冲液。
[0073]8.重复洗涤步骤3次。
[0074]9.在磁珠中加入5ml 0.1M PH3.0的甘氨酸缓冲液，混匀。使磁珠上的乳铁蛋白洗脱下来。
[0075]10.将磁珠放入磁力架中使磁珠贴壁，将洗脱的缓冲液取出到另一试管中，马上加入500ul PH9.0 IM Tris缓冲液，充分混合。
[0076]11.洗脱后的缓冲液用高效液相色谱(HPLC)检测其含量。
[0077]12.高效液相色谱检测结果如图2所示，根据HPLC检测图谱可以得出该奶粉样本中乳铁蛋白含量为100PPM。
【主权项】
1.一种乳铁蛋白的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠载体、蛋白G或者蛋白A和乳铁蛋白抗体。2.根据权利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通过共价键偶联在载体上，乳铁蛋白抗体与蛋白G结合，用交联剂交联，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-乳铁蛋白抗体偶联载体。3.根据权利要求1中所述的乳铁蛋白定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重组表达的蛋白G。4.根据权利要求1中所述的乳铁蛋白定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重组表达的蛋白A。5.根据权利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列I表达的蛋白G，以及经过序列优化后表达的蛋白G。6.根据权利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表达的蛋白A，以及经过序列优化后表达的蛋白A。7.根据权利要求1中所述的载体，包括纳米磁珠以及直径超过Iμ m的普通磁珠。8.根据权利要求2中所述的抗乳铁蛋白抗体，其特征在于包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9.一种纯化乳铁蛋白的定向免疫磁珠制备方法，其特征在于: 1)将磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES缓冲液悬起； 2)在磁珠中加入EDC至终浓度5-20mg/ml，再加入Sulfo-NHS至终浓度10_25mg/ml； 室温反应15-60分钟； 3)反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mM PH6.0的MES缓冲液中； 4)将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到5-10:1 ； 5)室温反应2-4小时； 6)反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次； 7)反应后的磁珠用IM的乙醇胺室温封闭； 8)磁珠用20mMPBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mM PBS PH7.4缓冲液中； 9)在磁珠中加入抗乳铁蛋白抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1; 10)将加入抗体的磁珠在37°C反应10-40分钟； 11)磁珠用0.1M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在IM PH9.0的硼酸缓冲液中； 12)将乳铁蛋白抗体一蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的DMP，PH8.3.室温反应1-2小时； 13)用50mMPH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的1mM PBS PH7.4洗涤乳14)铁蛋白抗体一蛋白G/蛋白A —磁珠3次； 15)将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4中，放于4°C保存。10.一种乳铁蛋白的定向免疫磁珠，其用于包括粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中乳铁蛋白的分离纯化，纯化后的乳铁蛋白可以用于高效液相色谱及其它方法检 bo fiV/TL
【文档编号】G01N33/553GK105842456SQ201510016971
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月14日
【发明人】张彦明, 柳家鹏
【申请人】北京康诺生物科技有限公司