一种分离纯化大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的方法
【专利摘要】一种大鼠肠黏膜组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其特征在于刮取大乳鼠空肠黏膜组织用酶消化处理为单细胞悬液，采用免疫磁珠分选技术获得纯化的目标细胞。取大乳鼠空肠黏膜组织，用II型胶原酶消化制备单细胞悬液，然后与CD31免疫磁珠孵育结合，利用磁珠分选纯化系统筛选CD31+细胞，DNaseI溶液消化去除CD31+细胞结合的磁珠，获得高纯度的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞。本发明的优点是通过酶消化制备单细胞悬液和免疫磁珠分选纯化，可以从大鼠肠黏膜组织中分离提取到高纯度的微血管内皮细胞。
【专利说明】一种分离纯化大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从大鼠肠黏膜组织中分离提取高纯度微血管内皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 肠黏膜微血管内皮细胞是位于动物肠道黏膜层微血管内表面的单层扁平上皮细 胞，是肠道内营养物质和药物吸收进入血液循环系统的必经部位，也是动物体防御致病因 子经由肠道造成全身性感染的关键屏障，具有广泛的生物学功能。体外培养微血管内皮细 胞是研究其生物学特性和功能的重要方法，当前多采用酶消化法或者组织贴块法，大鼠作 为常用实验动物其肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养更为常用。与其它组织器官相似，肠 黏膜微血管也存在难以分离的问题，制约了其内皮细胞的分离纯化。
[0003] Haraldsen等于1995年方率先利用酶消化法培养了人空肠黏膜微血管内皮细胞， 为其它动物肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养提供了重要的技术参考。由于微血管内皮细 胞大鼠的肠管较细、肠壁较薄，肠黏膜组织分离较困难，所以有关大鼠肠黏膜微血管内皮细 胞体外培养的报道较晚。索占伟等于2005年在国内首次报道了利用酶消化结合组织贴块 法对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养，是当前最常被引用的参考方法，但其通过去 除浆膜层的方法采取的肠黏膜组织未能充分去除黏膜下层和肌层组织，利用胰蛋白酶消化 获取肠黏膜微血管段进行贴块培养的方法操作难度大，且胰蛋白酶长时间消化易对细胞造 成损伤，差速贴壁进行纯化的方法亦难以避免其它杂细胞的污染，获得细胞培养物中肠黏 膜微血管内皮细胞的纯度较低。
[0004] 本发明利用眼科镊刮取大鼠肠黏膜组织，用胶原酶 II型溶液消化获得单细胞悬液，利用CD31免疫磁珠分选技术进行纯化，可获得高纯度的 CD31+细胞。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种分离培养高纯度大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种从大鼠肠黏膜组织分离培养高纯度微血管内皮细胞的方法，其步骤如下： A. 将大乳鼠断颈处死，剖开腹腔，无菌取出空肠，置于4°C预冷Hank' s液，剔除肠系 膜，剪为长约3 cm小段，纵向剖开肠管，用预冷Hank' s轻轻漂洗3遍，刮取肠黏膜组织； B. 将刮取的肠黏膜组织移入0.2%胶原酶II溶液，37°C消化约30 min，其间用移液器 吹打数次，肠黏膜组织消化为黏液状为止； C. 将肠黏膜消化液用200目细胞筛网过滤，收集滤液80(Tl200 rpm离心5~10 min，沉 淀细胞团用含有〇. 1%牛血清白蛋白、2 mM EDTA的0.01 M PBS重悬为密度约IX IO7个/ mL单细胞悬液； D. 将单细胞悬液样品中加入CD31免疫磁珠，孵育得到细胞-CD31免疫磁珠复合物。所 述的CD31免疫磁珠为CD31单克隆抗体与磁珠在4° C孵育过夜获得，磁珠密度约为4X IO8 个/mL，每毫升单细胞悬液加 CD31免疫磁珠25 μ L ;所述的单细胞悬液与CD31免疫磁珠孵 育处理，置于旋转摇床，温度为15?20° C，时间为3(T60 min ; E. 将所述的细胞-CD31免疫磁珠复合物从未结合磁珠和细胞中分离。所述的分离处 理使用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s，重复4次；每毫升单细胞悬液样品中收集的细胞-⑶31免疫磁珠复合物置于200 μ L含 5%胎牛血清、I mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基； F. 将所述的细胞-CD31免疫磁珠复合物收集液中加入释放缓冲液，孵育后去除细胞 表面结合的磁珠。所述释放缓冲液为DNase I溶液，每200 μ L收集液加4 μ L，孵育温度 为室温，孵育时间为ΚΓ20 min;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序 设置为：中速混合I min，收集2次、每次I s，中速释放3 s，重复1次； G. 将所述去除磁珠的CD31+细胞离心，用完全培养基重悬，接种孵育培养。所述的离 心处理，转速为80(Tl200 rpm，时间为5~10 min ;所述的完全培养基为DMEM培养基，含20% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL链霉素；所述的接种培养细胞密 度为IX IO5个/mL; H. 所述的接种培养细胞每3天换一次完全培养基，至亚汇合状态时传代培养。所述 的传代培养用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脱壁，传代密度为 lX105f/mL。
【具体实施方式】 [0007] 实施例一： I. 主要实验材料 (1) 实验动物：5日龄SD大乳鼠； (2) Hank' s 液：购自 GIBCO 公司，货号 14170-112 ; (3) 0.01 M PBS :取 NaCl 8.0 g、Na2HP04 2.9 g、KH2P04 0.2 g、KCl 0.2 g，溶解于 1000 mL超纯水中，0. 22 μ m过滤除菌，于4°C冰箱贮存； (4) 0. 2%胶原酶II溶液：用不含钙镁离子的Hank's液配制，0. 22 μ m无菌滤器过滤除 菌，胶原酶Π 购自Worthington公司、货号LS004176 ; (5) 完全培养基：DMEM基础培养基(购自GIBCO公司，货号11960-044)，含20%胎 牛血清(购自GIBCO公司，货号10099-141)、2 mM L-谷氨酰胺(购自GIBCO公司，货号 25030-081 )、1%双抗溶液（100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素，购自GIBCO公司，货号 15140-122)； (6) 小鼠抗大鼠 CD31单克隆抗体：购自AbD Serotec公司，货号MCA 1334G，规格为200 μ 1 (含200 μ g),每25 μ 1磁珠使用0· 5 μ g抗体； (7) 小鼠 IgG磁珠试剂盒：包括5 ml密度为4X IO8个/mL包被抗小鼠 IgG的磁珠，3 管释放缓冲液成分1 (每管为1500(Γ20000 U冻干DNase 1)，及2 ml释放缓冲液成分2 ; 释放缓冲液的配制为每管成分1加〇. 3ml成分2溶解，分装冻存，每毫升样品加4 μ 1 ; (8) 样品缓冲液：用0. 01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA，0. 22 μπι 无菌滤器过滤除菌； (9) 磁珠清洗液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白，0.22 μ m无菌滤器过 滤除菌； (10) 0. OOSffiDTA-O. 05%胰蛋白酶溶液：用0. 01 M PBS配制，0. 22 μ m无菌滤器过滤 除菌，EDTA购自SIGMA公司、货号E6511，胰蛋白酶购自SIGMA公司、货号T7309. 2.操作步骤 (1)免疫磁珠的⑶31抗体包被 取250 μ 1免疫磁珠，于KingFisher 96磁珠分选纯化系统中洗涤，程序设置为：慢速 混合60 s，收集3次、每次2 s，中速释放2 s ;重复3次。洗涤后的免疫磁珠悬浮于250 μ 1 磁珠清洗液，加入5 μ 1小鼠抗大鼠⑶31单克隆抗体，置于旋转摇床于4°C孵育过夜，于 KingFisher 96磁珠分选纯化系统中洗去未结合抗体，程序设置同前述磁珠的洗漆，洗漆后 的⑶31免疫磁珠重悬于250 μ 1磁珠清洗液，于4° C贮存备用。
[0008] (2)大鼠肠黏膜组织单细胞悬液样品的制备 5日龄大乳鼠5只，脱颈处死，剖开腹腔，无菌取出空肠，于4° C预冷Hank's液漂洗2-3 遍，并剔除肠系膜，将肠管剪为约3 cm小段，纵向剖开肠段，用预冷Hank' s轻轻漂洗3遍， 刮取肠黏膜组织于〇. 2%胶原酶II溶液，于37° C培养箱中消化约30 min，其间用移液器吹打 3次，至肠黏膜组织消化为黏液状。消化液用200目细胞筛网过滤，收集滤液，1000 rpm离 心8 min，沉淀细胞团用10 ml样品缓冲液重悬为单细胞悬液密度约IX IO7个/mL的单细 胞样品溶液。
[0009] (3)⑶31+细胞的分选与培养 将250 μ 1⑶31免疫磁珠加入10 ml单细胞样品溶液，置于旋转摇床，于10° C孵育60 min，然后利用KingFisher 96磁珠分选纯化系统分选细胞-CD31免疫磁珠复合物，程序设 置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重复4次。分选出的细胞-⑶31免疫磁珠复合物 释放于2 ml含5%胎牛血清、I mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基，并加入40 μ L释 放缓冲液，室温孵育15 min，于KingFisher 96磁珠分选纯化系统除去免疫磁珠，程序设置 为：中速混合I min，收集2次、每次I s，中速释放3 s ;重复1次。去除免疫磁珠的⑶31+ 细胞悬液于1000 rpm离心8 min，沉淀细胞团重悬于完全培养基，按I X IO5个/mL密度接 种培养。
[0010] 传代培养的⑶31+大鼠肠黏膜微血管内皮细胞每3天换一次完全培养基，至其生 长为亚汇合状态，用0. 005%EDTA-0. 05%胰蛋白酶溶液消化脱壁和传代，传代密度为I X IO5 个 /mL。
[0011] 3.培养结果 分离纯化的高纯度⑶31+大鼠肠黏膜微血管内皮细胞在接种约7天生长至汇合状态， 细胞呈短梭形或多角形，细胞核明显，汇合后呈典型的"鹅卵石样"外观，单层镶嵌状排列生 长，见图2,能够连续传代30次以上。
[0012] 4.【专利附图】
【附图说明】 图1大鼠肠黏膜大细胞悬液样品与CD31免疫磁珠的孵育结合，箭头示结合多个CD31 免疫磁珠的细胞，标尺为50 μπι; 图2体外培养生长汇合状态的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞，标尺为200 μ m。
【权利要求】
1. 一种从大鼠肠黏膜组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其特征在于：所述的 方法主要涉及大鼠肠黏膜组织的单细胞悬液制备和CD31+细胞的免疫磁珠分选，与传统肠 黏膜组织微血管内皮细胞分离纯化方法比较具有纯度高的特点。
2. 根据权利要求1所述的一种从大鼠肠黏膜组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方 法，其特征在于该方法包括以下步骤： A.将大乳鼠断颈处死，剖开腹腔，无菌取出空肠，置于4° C预冷Hank' s液，剔除肠系 膜，剪为长约3 cm小段，纵向剖开肠管，用预冷Hank' s轻轻漂洗3遍，刮取肠黏膜组织； B. 将所述刮取的肠黏膜组织移入消化液中消化；所述的消化液为0.2%胶原酶 II溶液，消化温度为37°C，消化时间约为30min，其间用移液器吹打数次，肠黏膜组织消化 为黏液状为止； C. 将所述肠黏膜消化液用200目细胞筛网过滤，收集滤液离心，沉淀细胞团用0.01M PBS重悬为单细胞悬液；所述离心处理，转速为80(Tl200rpm，时间为5?10min;所述0. 01 MPBS含有0. 1%牛血清白蛋白、2mMEDTA;所述的单细胞悬液密度约为IX107个/mL; D. 将所述的单细胞悬液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到细胞-CD31免疫磁珠复合物； 所述的CD31免疫磁珠为CD31单克隆抗体与磁珠孵育结合获得，孵育温度为4°C，时间为过 夜，磁珠密度约为4X108个/mL，每毫升单细胞悬液加CD31免疫磁珠25yL;所述的单细 胞悬液与⑶31免疫磁珠孵育处理，置于旋转摇床，温度为15~20°C，时间为3(T60min; E.将所述的细胞-CD31免疫磁珠复合物从未结合磁珠和细胞中分离；所述的分离处 理使用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s，重复4次；每毫升单细胞悬液样品中收集的细胞-⑶31免疫磁珠复合物置于200 iiL含 5%胎牛血清、1 mM氯化钙和4mM氯化镁的DMEM培养基； F. 将所述的细胞-CD31免疫磁珠复合物收集液中加入释放缓冲液，孵育后去除细胞 表面结合的磁珠；所述释放缓冲液为DNaseI溶液，每200yL收集液加4yL，孵育温度为 室温，孵育时间为10~20min;所述去除磁珠用KingFisher96磁珠分选纯化系统，程序设 置为：中速混合1min，收集2次、每次1s，中速释放3s，重复1次； G. 将所述去除磁珠的CD31+细胞离心，用完全培养基重悬，接种孵育培养；所述的离 心处理，转速为80(Tl200rpm，时间为5~10min;所述的完全培养基为DMEM培养基，含20% 胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100IU青霉素和100iig/mL链霉素；所述的接种培养细胞密 度为1X105个/mL; H. 所述的接种培养细胞每3天换一次完全培养基，至亚汇合状态时传代培养；所述的 传代培养用含〇. 05%胰蛋白酶和0. 005%EDTA的0. 01MPBS溶液消化脱壁，传代密度为 lX105f/mL。
【文档编号】C12N5/071GK104403990SQ201410618769
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】张涛, 穆祥, 胡格, 姜代勋, 董虹, 孙雄, 杨重锦 申请人:北京农学院