专利名称：一种新的大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法
技术领域：
本发明涉及一种新的大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法，属于细胞生物学及生 物技术学领域。
背景技术：
胰腺导管上皮细胞(Pancreatic duct epithelial cells，PDEC)与多数常见的胰 腺类疾病，如胰腺癌、胰腺炎、糖尿病等关系密切。据报道，90%以上的胰腺癌起源于胰腺导 管上皮细胞，而在急性胰腺炎的始发环节中胰腺导管上皮细胞不仅起到粘液屏障的作用， 还能分泌含有高浓度HC03_的碱液抑制胰蛋白酶的活性，以防止胰腺的自身消化。近年来， 热点研究关注于将自身胰腺导管上皮细胞诱导分化为胰岛细胞，有望解决可移植胰岛来源 少及排异反应等问题，其在糖尿病治疗中的潜在价值逐步得到体现。因此，建立一个良好的 体外原代培养胰腺导管上皮细胞的体系，可为探索肿瘤转移、免疫始发及细胞分化等分子 机制提供可靠的实验基础。目前培养胰腺导管上皮细胞的方法包括酶消化法和组织块贴壁法，动物来源多为 牛、猪等大型动物，成本较高、来源较少且难以进行大规模实验，而组织块贴壁法尚有周期 较长、成纤维细胞污染严重等缺点。大鼠作为目前最常见的实验动物之一，其繁殖率高，价 格便宜，且与人类基因组有很大相似性。然而，由于大鼠的胰腺导管结构细小、上皮来源少、 对酶消化敏感等特性，使其在胰腺类疾病体外研究中的应用受到了一定限制。已有文献报 道了大鼠的胰腺导管上皮细胞的培养、分离、纯化方法，如刘涛，等，大鼠胰腺导管上皮细 胞体外分离与定向分化，《中华器官移植杂志》，2007年28卷8期，报道了分离和纯化大鼠的 胰腺导管上皮细胞，在体外培养并诱导其向胰岛细胞定向分化。该方法取整个胰腺，采用胶 原酶逆行灌注法消化、Ficoll密度梯度离心结合不同细胞贴壁差异性分离和纯化胰腺导管 上皮细胞；结果CK-19染色结果证实所获细胞绝大多为导管上皮细胞。结论采用密度梯度 离心结合差异贴壁法可获得纯化的大鼠胰腺导管上皮细胞。陈锦鹏，等，大鼠胰腺导管上皮 细胞体外诱导分化，《江苏医药》，2008年34卷11期，也是取整个胰腺进行消化，采用Ficoll 密度梯度离心法；上述报道的方法均是采用分离液方法，成本高，不利于大规模应用。龙爱 梅，等，SD大鼠胰腺导管上皮细胞培养技术的研究，《江西医学院学报》，2005年45卷6期， 分离纯化SD大鼠胰腺导管上皮细胞，为将其转分化为胰岛细胞提供细胞来源。方法用酶 消化法培养SD大鼠胰腺导管上皮细胞，观察细胞增殖动态，用CK-19进行免疫组化鉴定。 结果胰腺导管上皮细胞可在体外有效扩增，有效去除成纤维细胞是扩增的关键。结论低 血清培养和反复贴壁法可获得较纯的胰腺导管上皮细胞。该方法取整个胰腺进行培养，且 仅使用IV型胶原酶。侯敏，等，人胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养，《解剖学报》，2000 年31卷2期取整个胰腺，采用混合消化酶进行消化，消化液为Hanks平衡液中加入胶原酶 IA型(Sigma)O. 5g/L，大豆胰酶抑制剂(Sigma)使其终浓度为0. 01 %，该文献报道的方法 虽然运用混合消化酶，但是消化过程并未分段，致使有些已经过度消化，而有些还未消化充 分。此外，其它报道的方法多是取用整个胰腺组织进行消化，消化过程中不分段，或是不同
3的步骤采用不同酶消化。采用整个胰腺的纳入会造成其他种类的细胞，特别是成纤维细胞 污染的可能会大大增加；不分步消化，会使有些细胞还未消化出来，而有些细胞已经因消化 过度而成碎片，降低细胞产量。Ficoll密度梯度离心法，成本高，不适合大规模生产；组织 块培养法时间长，且其余细胞污染严重。怎样准确地获取实验材料、怎样适度地控制酶消化 步骤、怎样有效地去除成纤维细胞污染等技术性的难题，目前仍存在争议。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种新的大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法。本发明提供了一种大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法，它包括以下工艺步骤a、从健康大鼠胰腺组织中分离主胰管；b、使用混合消化酶分步消化法对胰管组织碎块进行消化分离，获取细胞团；所述 的分步消化法为①取清洗后的胰管剪为碎块，加入胰管碎块4-5倍体积的混合消化酶消化10-15 分钟，加入HBSS溶液吹打、清洗，自然沉淀，弃去上清液；加入剩余胰管碎块2-2. 5倍体积的 混合消化酶消化5分钟，胎牛血清FBS终止消化，自然沉淀后弃去上清液；②在①步骤的剩余胰管碎块中加入2-4倍体积的混合消化酶，消化5分钟，胎牛血 清FBS终止消化，自然沉淀，收集消化液；重复前述步骤，继续消化剩余胰管碎块，直至无肉 眼可见胰管碎块，合并收集的消化液放至离心管中，离心，弃上清，即得细胞团；所述的混合消化酶溶液中含有0. 1-0. 2 % w/wV型胶原酶、0. 1-0. 2% w/w透明 质酸酶、0. 1-0. 2% w/w大豆胰酶抑制剂；所述的消化温度为37 °C ；消化过程中PH值为 8. 0-8. 5 ；C、细胞团纯化培养，即得胰腺导管上皮细胞。进一步优选地，所述的混合消化酶配方为0. w/wV型胶原酶，0. w/w透明质 酸酶，0. 1% w/w大豆胰酶抑制剂。其中a步骤选取的仅仅为主胰管，而并非传统培养方式所选用的整个胰腺组织； 且分离过程在胰管仍附着于周围器官上时进行，可利用周围器官张力使其得到干净、快速 的剥离。具体解剖方式为两把镊子同时提起胃幽门部和十二指肠近端，完全暴露胰腺头 部。在灯光照射下可见一宽度约为Imm左右黄色透明管状体呈30-45度角横跨胰腺头部， 此即为主胰管。小心去除主胰管周围胰腺组织，应尽量剔除干净。游离出主胰管后，将其剪 下置于提前准备好的5-6ml冰HBSS溶液中。在选取实验材料时仅取用主胰管这极大的减少了腺泡细胞在消化过程中腺泡细 胞破裂对上皮细胞的伤害，以及间质细胞的污染机会。其中，所述步骤b中的混合消化酶分步消化法的具体工艺步骤为(1)将获取的胰管置于无菌的生物安全柜中，转移至培养皿，冰HBSS冲洗三次以 上；(2)眼科剪将胰管剪为l_2mm碎块，置于15ml离心管中；(3)加入2ml混合消化酶于37°C水浴箱消化10_15分钟，每隔3_4分钟振荡摇晃， 混合消化酶的体积为胰管碎块体积的4-5倍；(4)加入6_8ml HBSS，待肉眼可见的胰管碎块自然沉淀后，弃去上清液；
(5)另加入Iml混合消化酶继续于37°C水浴箱中消化5分钟；(6)0. 5ml胎牛血清FBS终止消化，待其自然沉淀后，弃上清；(7)加入Iml混合消化酶，37°C消化5分钟，期间吹打并摇动；(8)0. 5ml胎牛血清FBS终止消化并自然沉淀，收集液体至一无菌离心管中；(9)重复步骤(7)、⑶三至四次，直至无肉眼可见胰管碎块；(10)将收集到的液体1600rmp离心10分钟，弃上清；(Il)HBSS重悬细胞，1200rmp再次离心5分钟，弃上清；(12)加入4ml高血清培养基，重悬细胞团，吹打均勻后种于60mm2无菌培养皿中；(13)在 37°C，5% CO2 孵箱中培养。上述混合消化酶消化过程中pH值为8. 0-8. 5。其中，步骤(3)中水浴箱消化12分钟。其中，所述HBSS溶液为1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化钠、0. 25g氯化镁、1.8g葡 萄糖和2. 24g HEPES配制而成。进一步地，所述的HBSS溶液中加入500U/ml青霉素和5 μ g/ml链霉素。所述步骤c的纯化、培养方法为将细胞团中加入高血清培养基，重悬细胞团，种 于无菌培养皿中；在37°C，5% CO2孵箱中培养后，进行时差转皿、使用梯度血清培养基联合 纯化，得胰腺导管上皮细胞。进一步地，所述步骤c的纯化方法为①时差转皿操作在37°C，5% CO2孵箱中孵育两小时后，进行转皿操作；所谓的 “时差转皿”，就是利用成纤维细胞、间质细胞贴壁较快，通常在孵育两小时后即可贴壁伸 展，而上皮细胞则需要24小时左右；通过此差速贴壁法，可有效去除间质细胞污染。②培养的不同阶段选用不同血清浓度培养基在细胞培养0-48小时期间，选用含 20%胎牛血清FBS的高血清培养基进行培养；细胞培养48-72小时的过程中，细胞团完全贴 壁后，即更换为含2%胎牛血清FBS的低血清培养基。在低血清培养基中，间质细胞因营养 不足而死亡，上皮细胞却由于其中添加了 EGF (上皮生长因子)，胰岛素，霍乱毒素等生长因 子，生长状态保持良好。其中，所述高血清培养基配方为=IMEMZO培养基中加入20%胎牛血清FBS，5 μ g/ ml胰岛素，100ng/ml表皮生长因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍乱毒素，100ng/ml转铁 蛋白，500U/ml青霉素，5μ g/ml链霉素；所述的低血清培养基配方为=IMEMZO培养基中加入 2%胎牛血清FBS，5 μ g/ml胰岛素，100ng/ml表皮生长因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍 乱毒素，lOOng/ml转铁蛋白，200U/ml青霉素，2 μ g/ml链霉素。对获取细胞进行形态学(光镜下形态和亚显微结构)以及细胞标志物CK19的鉴 定；对鉴定后的细胞进行生长特性的观察并对实验研究提供有效的操作建议。形态学鉴定 分别在光镜(OLYMPUS C-5060)下观察形态结构以及在透射电镜(HITACHI H-600IV)下检 测其亚显微水平结构。细胞标志物鉴定选取的角蛋白19 (CK19)，分别进行了 RNA水平和蛋 白水平的检测。CK 19为包括胰腺导管在内的简单上皮细胞骨架上的特异性蛋白。培养细 胞的CK-19mRNA水平通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实现，其蛋白水平检测通过免疫 组化实现。本发明与现有技术相比具有以下有益效果
1、动物来源为常见的实验动物大鼠，避免了以往使用牛、猪等大型动物成本较高、 来源较少且难以进行大规模实验等缺点。2、在实验材料的选取上仅仅纳入了主胰管，本发明提供的新的解剖方式，可利用 主胰管周围器官的张力使其能从整体胰腺组织中得到快速有效的剥离。3、本发明使用了混合消化酶分步消化法。混合消化酶可提前制备，简化了现有技 术的实验步骤，并且减少了实验过程中频繁换酶所引起的污染机会。分步消化的方式可得 到大小适宜的细胞团，所得培养细胞产量可比整体消化法提高了 60%以上。4、联合使用取材、时差转皿、使用梯度血清培养基三种方式去除其余胰腺细胞污 染，纯化上皮细胞。该发明的上皮细胞纯化率可达95%。5、本发明还观察和描述了大鼠胰腺导管上皮细胞的生长特性，对后来研究者的实 验设计提供一些有效的建议。
图1解剖方式及分离出的主胰管图2光镜下显示培养细胞形态200 X图3透射电镜下培养细胞的亚显微结构10000X (箭头指示微绒毛，*指示细胞间 紧密连接)图4透射电镜下培养细胞的亚显微结构25000 X (箭头指示桥粒结构)图 5CK-19 的 RT-PCR 电泳6免疫组化分析中培养细胞呈阳性表达200X (CK-19为细胞膜着色，胞核用苏 木素复染)图7种皿时PDEC细胞团200 X (箭头所指为上皮细胞团)图8培养48小时细胞100X图9培养72小时细胞40 X图10培养4-5天细胞40 X图11培养第8天细胞200 X (箭头指示空泡)
具体实施例方式实施例1本发明大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法1主要实验材料1)高血清培养基IMEMZO培养基加入20 %胎牛血清FBS，5 μ g/ml胰岛素， 100ng/ml表皮生长因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍乱毒素，100ng/ml转铁蛋白，500U/ ml青霉素，5 μ g/ml链霉素。2)低血清培养基=IMEMZO培养基中加入2%胎牛血清FBS，200U/ml青霉素，2 μ g/ ml链霉素。其余添加物同上。3)混合消化酶0. V型胶原酶，0. 透明质酸酶，0. 大豆胰酶抑制剂。所 有酶都来源于sigma公司，美国密苏里州的圣路易斯市；4)缓冲盐溶液(HBSS)加入500U/ml青霉素，5 μ g/ml链霉素的Hank，s溶液。所述的缓冲盐溶液(HBSS)可以自配，也可直接购买市售产品。
5)实验动物健康Wistar大鼠4只，雌雄不限，体重120 150g，由四川大学实验 动物中心提供。试验操作遵照国家动物保护法执行。2操作步骤1)从健康大鼠胰腺组织中，使用适当的解剖方式获取主胰管取健康Wistar大鼠，10%水合氯醛麻醉(5mg/g)。碘酊和酒精消毒，无菌操作开 腹。两把镊子同时提起胃幽门部和十二指肠近端，完全暴露胰腺头部。在灯光照射下可见 一宽度约为Imm左右黄色透明管状体呈30-45度角横跨胰腺头部，此即为主胰管。小心去 除主胰管周围胰腺组织，应尽量剔除干净。游离出主胰管后，将其剪下置于提前准备好的 5-6ml冰HBSS溶液中。(见图1)2)使用混合消化酶分步消化法对组织碎块进行消化分离操作者更换无菌衣并消毒，以下步骤需在无菌条件下完成。A.将获取的胰管置于无菌的生物安全柜中，转移至培养皿，冰HBSS冲洗三次以 上。B.眼科剪将胰管剪为l_2mm碎块，置于15ml离心管中。C.加入2ml混合消化酶，于37°C水浴箱消化12分钟，每隔3_4分钟振荡摇晃；混 合消化酶的体积为胰管碎块体积的4-5倍。D.加入6_8ml HBSS，待肉眼可见的胰管碎块沉下后，弃去上清液。E.另加入Iml混合消化酶继续于37°C水浴箱中消化5分钟。F. 0. 5ml胎牛血清FBS终止消化，待其自然沉淀后，弃上清。G.加入Iml混合消化酶，37°C消化5分钟，期间吹打并摇动。H. 0. 5ml胎牛血清FBS终止消化并自然沉淀，收集液体至一无菌离心管中。I.重复步骤8三至四次，直至无肉眼可见胰管碎块。J.将收集到的液体1600rmp离心10分钟，弃上清。K. HBSS重悬细胞，1200rmp再次离心5分钟，弃上清。L.加入4ml高血清培养基，重悬细胞团，吹打均勻后种于60mm2无菌培养皿中。M. 37°C,5% CO2 孵箱中培养。3)对所获取细胞团进行培养以及纯化将消化分离得到细胞在60mm2培养皿中培养两小时后，轻轻摇晃转于4ml高血清 培养基中，培养48-72小时，待细胞团完全贴壁后即更换于4ml低血清培养基中。4)对培养增殖细胞进行形态学以及细胞标志物的鉴定待培养细胞处于生长旺盛期时，从形态学和细胞标志物CK-19两方面对其进行鉴定。形态学鉴定①在OLYMPUS C-5060光学显微镜下观察所得细胞的外形特点。②透 射电镜观察培养细胞的亚显微结构细胞标志物CK-19的检测CK 19为包括胰腺导管在内的简单上皮细胞骨架上的 特异性蛋白。①用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测所得细胞中CK 19mRNA的表达。 ②用免疫组化SP三步法检测所获细胞中CK19蛋白的表达。5)对鉴定后的细胞进行生长特性的观察每日在OLYMPUS C-5060光学显微镜下观察培养细胞的生长状态及形态变化。
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3实验结果(1)通过上述方法，我们获得了生长状态良好且数量充足的细胞。该原代培养系统
已重复三次以上，实验重复率高。(2)形态学水平鉴定结果光镜下观察，培养细胞呈多角形，铺路石样紧密排列。 具有典型的上皮样细胞形态特点(图2)。透射电镜亚显微结构显示，该细胞具有明显的微 绒毛、桥粒样结构和细胞间的紧密连接复合物。此为上皮细胞亚显微结构典型特点(图3、 图4)。(3) CK-19鉴定结果CK-19mRNA表达结果CK19的扩增产物显示为248bp的单一 条带(Maker为DL2000)。该结果表明，扩增产物CK19高度特异地在培养细胞上表达(图 5)。CK-19蛋白表达结果所获细胞在免疫组化检测中95%以上呈阳性表达。这表明我们 所获的细胞能特异性的表达CK-19蛋白，且所获细胞具有较高的纯度(图6)。由图6可以 看出，通过三次以上的重复试验，CK-19阳性染色率可高达95%。(4)大鼠胰腺导管上皮细胞生长特性观察将酶消化分离所得的细胞种于培养皿中后，可观察到大部分细胞小而圆，且 5-10个聚集成团，此即为所需的导管上皮细胞团。同时，这些细胞团中通常会夹杂一些间质 细胞，红细胞，及腺泡细胞团(图7)。孵育24小时后，大部分上皮细胞团可贴壁。培养第二 天，全部PDEC细胞团贴壁，细胞从贴壁的集落中心向四周扩展。与细胞团相比，单个的细胞 反而不容易贴壁扩增的。这些扩增出的细胞为多角形，呈铺路石样排列为单层细胞(图8)。 培养第三天，细胞繁殖速度加快，生长旺盛。此时细胞集落蔓延至第二天的5倍大小，细胞 几乎覆盖了培养皿的50% (图9)。在随后的1-2天中，细胞继续快速生长，细胞集落汇合， 整个培养皿的80%被生长的上皮细胞所占据(图10)。至第6-7天，细胞生活力降低，虽仍 有增长，但贴壁的细胞团已开始脱落。至培养第八天，细胞团拉网现象明显，大部分细胞出 现空泡(图11)。培养第十二天，大部分细胞死亡；14-15天，所有细胞死亡。采用本发明方法与整体消化法(在选择的消化酶相同的情况下，不采用分步消化 法)进行比较，所得培养细胞产量提高了 60%以上。实施例2本发明大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法中混合消化酶的浓度选择 试验按实施例1的方法进行操作，三种酶每种浓度一致，以0.05%，0. 1%，0. 2%， 0. 5%共四个实验组进行对比。试验结果0. 05%组因浓度低，消化次数多，时间长，细胞未能充分从组织块中游 离出来。0.5%在消化过程中就出现明显的消化过度，细胞碎片多，出现胶状物缠绕在一起。 0. 1%和0. 2%组消化过程差不多。但从最后产量上看，0. 组多于0. 2%组多于0. 05%组 多于0.5%组。所以酶浓度可在0. 至0.2%之间，其中以0. 最优。综上所述，本发明大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法采用实验动物大鼠，成本 低、来源广；在实验材料的选取上仅纳入了主胰管，利用主胰管周围器官的张力使其能从整 体胰腺组织中得到快速有效的剥离。使用了混合消化酶分步消化法；混合消化酶可提前制 备，简化了现有技术的实验步骤，并且减少了实验过程中频繁换酶所引起的污染机会；分步 消化的方式可得到大小适宜的细胞团，所得培养细胞产量可比整体消化法提高了 60%以 上。再联合使用取材、时差转皿、使用梯度血清培养基三种方式去除其余胰腺细胞污染，纯化上皮细胞；本发明的上皮细胞纯化率可达95 %以上。
权利要求
一种大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法，它包括以下工艺步骤a、从健康大鼠胰腺组织中分离主胰管；b、使用混合消化酶分步消化法对胰管组织碎块进行消化分离，获取细胞团；所述的分步消化法为①取清洗后的胰管剪为碎块，加入胰管碎块4 5倍体积的混合消化酶消化10 15分钟，加入HBSS溶液吹打、清洗，自然沉淀，弃去上清液；加入剩余胰管碎块2 2.5倍体积的混合消化酶消化5分钟，胎牛血清FBS终止消化，自然沉淀后弃去上清液；②在①步骤的剩余胰管碎块中加入2 4倍体积的混合消化酶，消化5分钟，胎牛血清FBS终止消化，自然沉淀，收集消化液；重复前述步骤，继续消化剩余胰管碎块，直至无肉眼可见胰管碎块，合并收集的消化液放至离心管中，离心，弃上清，即得细胞团；所述的混合消化酶溶液中含有0.1 0.2％w/wV型胶原酶、0.1 0.2％w/w透明质酸酶、0.1 0.2％w/w大豆胰酶抑制剂；所述的消化温度为37℃；c、将步骤b得到的细胞团进行纯化培养，即得胰腺导管上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的混合消化酶溶液中含有 0. 1 % w/wV型胶原酶，0. 1 % w/w透明质酸酶，0. 1 % w/w大豆胰酶抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于b步骤所述的离心速度为 1200rmp-1600rmp。
4.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于b步骤所述消化过程中pH值为 8. 0-8. 5。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述HBSS溶液为1000ml三蒸水中 加入7. 6g氯化钠、0. 25g氯化镁、1. 8g葡萄糖和2. 24g HEPES配制而成。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于所述的HBSS溶液中加入500U/ml青 霉素和5μβ/πι1链霉素。
7.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于所述步骤c的纯化培养方法为 在沉淀的细胞团中加入高血清培养基，重悬细胞团，种于无菌培养皿中；在37°C，5% 0)2孵 箱中培养后2小时后，进行时差转皿、使用梯度血清培养基联合纯化，得纯化率为95%以上 的胰腺导管上皮细胞。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于所述步骤c的纯化、培养方法为①时差转皿操作在37°C，5%CO2孵箱中孵育两小时后，进行转皿操作；②培养的不同阶段选用不同血清浓度培养基在细胞培养0-48小时期间，选用含有 20%胎牛血清FBS的高血清培养基进行培养；细胞培养48-72小时的过程中，细胞团完全贴 壁后，即更换为含2%胎牛血清FBS的低血清培养基。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于所述高血清培养基配方为=IMEMZO 培养基中加入20%胎牛血清FBS，5 μ g/ml胰岛素，100ng/ml表皮生长因子，4 μ g/ml地塞 米松，100ng/ml霍乱毒素，100ng/ml转铁蛋白，500U/ml青霉素，5 μ g/ml链霉素；所述的低 血清培养基配方为IMEMZ0培养基中加入2%胎牛血清FBS，5y g/ml胰岛素，100ng/ml表 皮生长因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍乱毒素，100ng/ml转铁蛋白，200U/ml青霉素， 2 μ g/ml链霉素。
全文摘要
本发明提供了一种新的大鼠胰腺导管上皮细胞原代培养方法；它包括以下工艺步骤a、从健康大鼠胰腺组织中分离主胰管；b、使用混合消化酶分步消化法对胰管组织碎块进行消化分离，获取细胞团；c、细胞团进行培养及纯化时差转皿、使用梯度血清培养基联合纯化，得胰腺导管上皮细胞。本发明方法原料来源于常见的实验动物大鼠，利用主胰管周围器官的张力使其能从整体胰腺组织中得到快速有效的剥离。分步消化的方式可得到大小适宜的细胞团，所得培养细胞产量可比整体消化法提高了60％以上。联合使用取材、时差转皿、使用梯度血清培养基三种方式去除其余胰腺细胞污染，纯化上皮细胞；本发明的上皮细胞纯化率可达95％。
文档编号C12N5/071GK101955909SQ201010233969
公开日2011年1月26日 申请日期2010年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者周总光, 李园, 郑雪莲, 陈珂玲 申请人:四川大学华西医院