专利名称：一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法
技术领域：
本发明涉及畜牧行业技术领域，具体地说是利用TLR2 (Toll-like rec印tor2)基 因特异启动子鉴别海福(Hereford)特纯种牛、海福特杂种牛和其它品种牛的方法。
背景技术：
根据2003年出版的《中国畜禽遗传资源状况》的调查数据显示，我国黄牛有69个 品种，其中地方品种52个，培育品种5个，引入品种12个，是世界上牛品种最多的国家。中 国本地黄牛曾经长期以役用为主，它具有肉品质优良、耐粗饲、抗逆性强等优点(邱怀等， 1986年)。然而，我国黄牛品种的绝大部分个体尚不具备优良肉牛品种的体型结构特点，存 在产肉性能较低、生长速度较慢、饲料报酬较低、母牛的泌乳性能较低等缺点，为了克服中 国黄牛的缺陷，几十年来，我国先后引进了 28个国外肉牛品种与当地黄牛进行杂交，均取 得了一定的效果，其中，引进的品种有西门塔尔牛、夏洛来、利木赞、海福特牛等。然而，许多 地方出现了盲目杂交，轻视选育的现象。企业和养殖户为了追求一时的高产，采取大量、盲 目的杂交改良，致使全国性牛品种混杂，固有品种的优良基因库与基因组合体系因杂交而 混乱，甚至解体。此外，近年来，由于一些品种缺乏肉用选育和导入改良的统一规划，进行 导入杂交时引入国外良种肉牛品种比较杂乱，甚至，在引种时，可能引入的个体就是杂种个 体，而非纯种牛个体。由于一些优良种质特性的基因资源丢失，从而导致种质和产肉性能的 下降。海福特(Hereford)牛原产于英国，是世界上最古老的早熟中小型肉牛品种，具有 生长快、早熟易肥、肉质好、饲料报酬高等优良的种质特性，它在世界肉牛业发展中起了重 要作用。我国于1964、1973和1974年分别从英国引进，1995-1996年又从北美引进大型海 福特牛品种(许尚忠等，2009)。纯种海福特牛具有典型的“六白”(四肢下部、腹下部、颈下 部、耆甲和尾帚呈白色)的外貌特征，海福特牛与我国黄牛杂交效果较好，然而，半数一代 杂种海福特牛还具有“六白”特征，因此，仅依据其外貌特征，很难鉴别纯种海福特牛和杂种 的海福特牛。那么，如何识别纯种海福特牛和杂种海福特牛，是一个亟待解决的问题，其在 品种的引进、品种的杂交改良与选育，以及牛肉贸易的标示等方面，具有非常重要的作用。 特有等位基因是指品种在所研究的座位上特有，而其它品种没有的等位基因。它在畜禽的 遗传多样性、品种起源、品种识别、产品追溯中发挥着越来越重要的作用。TLR2 (Toll-like receptor2)基因是 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLR)蛋 白基因家族重要成员之一，TLR2能够识别多种病原微生物及其产物，介导天然免疫，通过细 胞内信号转导，启动获得性免疫(Stevens等，2008)。牛TLR2基因定位在17号染色体上， 含有2个外显子，基因全长约13. 2kb，其mRNA长度约为3. 5kb，编码784个氨基酸(White 等，2003)。目前，已有相关研究报道了 TLR2基因的外显子和3’非翻译区的遗传变异在在中 国荷斯坦牛、渤海黑牛、鲁西黄牛、挪威红牛、瘤牛等群体中的遗传多样性，单核苷酸多态性 (SNPs)及其单倍型与牛乳腺炎的关系(马腾壑等，2007 ；Opsal等，2008 ；张翠霞等，2009 ； 刘利等，2009 ；Mariotti等，2009 ；Seabury等，2010)。但是，以上研究与相关文献报道中，还没有关于TLR2基因启动子区的相关研究，更没有利用LTR2基因启动子区的特异等位基因 来鉴别海福特纯种牛、海福特杂种牛及其它品种牛的报道。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种利用TLR2 (Toll-like receptor2)基因特异启动子鉴别海福特纯种牛、海福特杂种牛和其它品种牛的方法。本发明的技术方案是按以下方式实现的，本发明的鉴别海福特(Hereford)纯种 牛和杂种牛的方法，是先获得目标测试牛的基因，设计该基因TLR2基因的启动子区基因的 上游引物和下游引物，建立PCR反应体系，通过PCR方法来扩增TLR2基因的启动子区片段， 对扩增产物进行测序，通过鉴定TLR2基因启动子区的300bp 307bp位点的基因型，来 鉴别海福特纯种牛和杂种牛，还是其它品种的牛。当TLR2基因启动子区片段为627bp，且 300bp 307bp位点为AATGAATG/AATGAATG的纯合子时，则为纯种的海福特牛；当TLR2基 因启动子区片段为627bp，且300bp 307bp位点为AATGAATG/AATGCTTC杂合子时，则为杂 种的海福特牛；当TLR2基因启动子区片段为623bp，且300bp 307bp位点为AATGAATG/ AATGCTTC的纯合子时，则为其它品种的牛。所述的扩增TLR2基因启动子区的上游引物序列为SEQ ID NO. 4，下游引物序列 为SEQ ID NO. 5。所述的PCR反应体系是总体系为20 μ 1，其中包括10 IOOng的基因组DNA、 Ι.Ομ 1浓度为lOpmol/μ 1的上游引物、1. 0μ 1浓度为IOpmol/μ 1的下游引物，2.0μ 1 10XPCR Buffer (含镁离子 Mg2+)，2 μ 1 浓度为 0. 25mM 的 dNTPs、2. OU 酶活单位的 Taq DNA 聚合酶和灭菌水。所述的PCR方法扩增TLR2基因的启动子区的反应程序是94°C预变性4min ；94°C 变性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，进行35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。本发明与现有技术相比所产生的有益效果是海福特纯种牛、海福特杂种牛和其它品种牛的TLR2基因的启动子存在多态性差 异，通过对相关位点的检测，即利用鉴定品种特异的TLR2基因启动子，可以鉴别海福特纯 种牛、海福特杂种牛和其它品种的牛。本发明方法能够准确、方便地鉴别海福特纯种牛和杂种牛，并且易于实验室操作， 污染少，成本低，具有较强的实用性。本发明的方法在海福特牛的品种引进、海福特牛肉的进出口贸易、与本地牛的杂 交改良、肉牛新品系的培育、牛肉产品溯源等方面具有很好的应用前景，能够产生可观的经 济效益和良好的社会效益。
附图1是本发明的实施例一的测序图；附图2是本发明的实施例二的测序图；附图3是本发明的实施例三的测序图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明的一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法作以 下详细说明。本发明是通过对不同牛品种TLR2基因的启动子区序列和单核苷酸多态性(SNPs) 分析来揭示海福特纯种牛、海福特杂种牛及它品种牛的TLR2基因的启动子的遗传多样性 差异。研究对象包括，海福特牛纯种牛、海福特杂交1代牛、西门塔尔牛、利木赞牛、夏洛来 牛、娟姗牛、利木赞与鲁西黄牛的杂交牛、鲁西黄牛、渤海黑牛、海南黑牛、南阳牛、荷斯坦牛 奶牛等品种牛共425个体。采用常规的酚-氯仿抽提法从牛的血液中提取基因组DNA，用分光光度计或1 %的 琼脂糖凝胶电泳检测其DNA的浓度和纯度。从UCSC网站下载牛TLR2基因上游的2kb以及 5’-UTR(非翻译区)的序列作为参考序列，使用Matlnspector软件预测序列的启动子区域， 利用Primerf. 0软件设计特异性引物扩增牛TLR2基因的启动子区片段(627bp)。之后，采 用PCR扩增，将获得的PCR产物进行测序。测序序列结果利用ChromasPro vl. 41软件进行 分析，然后采用DNAMAN软件进行序列比对分析，寻找品种间的重要SNPs和品种特异的启动 子区。结果表明海福特纯种牛、海福特杂种牛和其它品种牛的TLR2基因启动子区SNP位点 存在多样性，并且存在品种特异的启动子。实施例1采用酚-氯仿抽提法从第一目标牛血液中提取基因组DNA，设计特异性引物用于 扩增TLR2基因启动子区片段，所用的引物序列为上游引物序列为=SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3，；下游引物序列为=SEQ ID NO. 5 TLR2-promoter_R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反应体系如下总体系为20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基 因组 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. 0 μ 1 10XPCR Buffer (含镁离子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和灭菌水。所用的PCR反应程序如下94°C预变性4min ；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，进行35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR产物经过琼脂糖电泳检测后进行测序，得到SEQ ID N0. 1，测序峰图如附 图1，片段长度为627bp，该序列中300bp 307bp的基因是AATGAATG的表现型为AA的纯 合子，鉴定结果为海福特纯种牛。实施例2采用酚-氯仿抽提法从第二目标牛血液中提取基因组DNA，设计特异性引物用于 扩增TLR2基因启动子区片段，所用的引物序列为上游引物序列为SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3‘；下游引物序列为=SEQ ID N0. 5 TLR2-promoter-R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反应体系如下总体系为20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基因组 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. O μ 1 10XPCR Buffer (含镁离子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和灭菌水。所用的PCR反应程序如下94°C预变性4min ；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，进行35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR产物经过琼脂糖电泳检测后进行测序，得到SEQ ID NO. 2，测序峰图如附 图2，片段长度为627bp，测序峰图中自300bp往后的测序峰程套峰，此现象说明该序列中 300bp 307bp的正链基因是AATGAATG，其互补链是前四位基因是TTAC且后四位基因缺失 的互补链的基因型，主链长度为627bp，互补链长度为623bp的表现型为AB的杂合子，鉴定 结果为海福特杂种牛。实施例3采用酚-氯仿抽提法从第三目标牛血液中提取基因组DNA，设计特异性引物用于 扩增TLR2基因启动子区片段，所用的引物序列为上游引物序列为=SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3，；下游引物序列为=SEQ ID N0. 5 TLR2-promoter-R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反应体系如下总体系为20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基 因组 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. 0 μ 1 10XPCR Buffer (含镁离子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和灭菌水。所用的PCR反应程序如下94°C预变性4min ；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，进行35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR产物经过1 %琼脂糖电泳检测后进行测序，得到SEQ ID N0. 3，测序峰图如附图 3，片段长度为623bp，该序列中300bp 307bp位点为AATGAATG/AATGCTTC的表现型为BB 的纯合子时，则为其它品种的牛。实施测序序列结果利用ChromasPro vl. 41软件进行分析，然后采用DNAMAN软件 进行序列比对分析，寻找品种间的重要SNPs和品种特异的启动子区。表1.不同牛品种TLR2基因启动子区的测序结果与300bp 307bp位点的基因型
权利要求
一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法，其特征在于先获得目标测试牛的基因，设计该基因TLR2基因的启动子区的上游引物和下游引物，建立聚合酶链反应PCR体系，通过PCR方法来扩增TLR2基因的启动子区片段，对扩增产物进行测序，通过鉴定TLR2基因启动子区的300bp～307bp位点的基因型，来鉴别海福特纯种牛和杂种牛，还是其它品种的牛。当TLR2基因启动子区片段为627bp，且300bp～307bp位点为AATGAATG/AATGAATG的纯合子时，则为纯种的海福特牛；当TLR2基因启动子区片段为627bp，且300bp～307bp位点为AATGAATG/AATGCTTC杂合子时，则为杂种的海福特牛；当TLR2基因启动子区片段为623bp，且300bp～307bp位点为AATGAATG/AATGCTTC的纯合子时，则为其它品种的牛。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法，其特征在于所述的 扩增TLR2基因启动子区的上游引物序列为=SEQ ID NO. 4，下游引物序列为=SEQ ID NO. 5。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法，其特征在于所述 的PCR反应体系是总体系为20 μ 1，其中包括10 IOOng的基因组DNA、1. 0 μ 1浓度为 IOpmol/μ 1 的上游引物、Ι.Ομ 1 浓度为 IOpmol/μ 1 的下游引物，2. Ομ 1 IOXPCR Buffer, 2 μ 1浓度为0. 25mM的dNTPs、2. OU酶活单位的Taq DNA聚合酶和灭菌水。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法，其特征在于所述的 PCR方法扩增TLR2基因的启动子区的反应程序是94°C预变性4min ；94°C变性30s，60°C退 火30s，72°C延伸45s，进行35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别海福特纯种牛和杂种牛的方法，其检测牛的TLR2基因的启动子区627bp的300bp～307bp位点来鉴定是海福特纯种牛或者是杂种牛，还是其它品种的牛。本发明的方法具有简便快速、准确可靠、成本低等特点，具有较强的实用性。本发明的方法在海福特牛的品种引进、海福特牛肉的进出口贸易、与本地牛的杂交改良、肉牛新品系的培育、肉牛产品的分子标识与溯源等方面具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101955999SQ20101023358
公开日2011年1月26日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者仲跻峰, 侯明海, 刘利, 李建斌, 李秋玲, 李荣岭, 王泽英, 王长法, 鞠志花, 黄金明 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心