专利名称：microRNA-21在鉴别胰腺癌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种将血中的microRNA作为标志物，鉴 别胰腺癌的方法。
背景技术：
microRNA最早发现于1993年，是一种小的、非编码蛋白质的单链RNA，由18 25 个核苷酸组成。microRNA通过与mRNA3’非翻译区(3’ UTR)结合，使得靶mRNA降解或抑制 其翻译，实现其生物学功能。经过20多年艰苦卓绝的努力，科学家对microRNA研究取得了 突破性进展，发现其在动物、植物和病毒中普遍存在，且在许多生命活动中起着非常重要的 作用。根据最新的microRNA数据库统计(miRBase Registry 13. 0)，人体已经发现了 706 种microRNA。microRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性。近来研究表明，某些microRNA在细胞的分化发育中起着重要的作用，提示其与肿 瘤的发生密切相关。通过特定的分子生物学技术(包括=Northern印记杂交、实时定量PCR， 上调或下调特定microRNA的表达等)，人们发现microRNA表达量的变化与很多肿瘤密切相 关，如肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、白血病等。功能学研究显示micr0RNA可能与癌基因或 抑癌基因起着同样的作用。超过50%的microRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或者不 稳定区域，这种现象提示，microRNA在部分肿瘤的发生过程中起着重要的作用。胰腺癌为消化道常见肿瘤，居全身恶性肿瘤第7位，其侵袭性强，恶性度高，手术 切除率低，预后极差，死亡率接近100%。且其起病隐匿，缺乏典型临床症状，早期诊断难 度极大，成为目前国内外肿瘤专家的研究热点。有报道同正常组织及慢性胰腺炎组织相 比，microRNA在胰腺癌组织中的表达谱有显著变化(Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F, Volinia S, Aider H, Hagan JP, Liu CG, Bhatt D, Taccioli C, Croce CM. 2007May 2 ； 297(17) 1901-8. LeeEJ,Gusev Y,Jiang J,Nuovo GJ,Lerner MR,Frankel WL,Morgan DL, PostierRG, Brackett DJ, Schmittgen TD.Int J Cancer. 2007Marl ； 120 (5) 1046-54.) {0 目前临床上胰腺组织标本的获取较为困难，如超声内镜引导下穿刺、CT引导下穿刺等方法 获取胰腺组织标本成功率低，费用高，痛苦大，并发症多，患者耐受性差。近来有多篇文章 报道，病变组织中mi croRNA的异常变化可以在血清中有所反映。(Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, Peterson A, Noteboom J, O' Briant KC, Allen A, Lin Dff, Urban N, Drescher Cff, Knudsen BS, Stirewalt DL, Gentleman R, Vessella RL, Nelson PS, Martin DB, Tewari M. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jul 29 ； 105 (30) 10513-8. Wang K, Zhang S, Marzolf B, Troisch P, Brightman A, Hu Z, Hood LE, Galas DJ. Proc Natl Acad Sci USA. 2009Mar 17 ；106(11) :4402_7·)。 利用检测血清中的microRNA表达水平，是一种没有创伤、价格低廉的方法，患者容易接受， 但至今未见有关利用检测血清中的microRNA-21表达水平来鉴别胰腺癌的报道。
发明内容
胰腺癌往往是在慢性胰腺炎基础上发生的，本发明提供一种通过检测血清中 microRNA-21的表达水平鉴别胰腺癌、慢性胰腺炎或正常胰腺的方法。本发明方法如下1.通过大样本检测，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表 达量标准图谱1)制备总 RNA 取胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者和正常人血液样本各若干例，将各例血液样本分 别进行离心，取血浆，将人工合成的micr0RNA(Cel-miR-39)分别加入各血浆作为参照物， 用美国 Molecular Research Center 公司的 TRI REAGENT BD(cat. no. TB 126)按常规抽提 总RNA，并检测各例胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人样本中的总RNA浓度。2)microRNA-21表达丰度的测定使用Applied Biosys terns 公司的 microRNA 检测试剂盒(TaciMan MicroRNAAssay, P/N =4373090)，以及荧光实时定量PCR技术，分别检测胰腺癌、慢性胰腺炎 及正常人血浆中mi croRNA-21的表达丰度值(Ct值)，用Ct 21表示。并用同样的方法测 得加入的参照物Cel-miR-39的Ct值Ct 39。3)制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱将各例所得Ct 39值减去Ct 21值，即得标准化后的表达丰度值(Δ Ct)。用胰腺 癌、慢性胰腺炎和正常人microRNA-21各组分别得到的表达丰度值Δ Ct，制作胰腺癌、慢性 胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱。2.鉴别胰腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺的方法按以上方法检测未知血浆标本中的microRNA-21表达丰度值ACt，对照上述 MicroRNA-21的表达量标准图谱，如果落入胰腺癌组microRNA-21的范围内，则将其归为胰 腺癌，如果落入慢性胰腺炎或正常胰腺组的的范围内，则基本排除胰腺癌。本发明方法具有检测方便、敏感性好、准确率高等特点。
图1为胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱图2为实施例1的诊断试验评价图，图中，胰腺癌血浆中MicroRNA-21表达水平列 为一组，慢性胰腺炎及正常人MicroRNA-21表达水平列为一组。
具体实施例方式现结合附图和实施例，对本发明作详细描述。实施例1制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱1.血浆采集选取31例胰腺癌、14例慢性胰腺炎及10例正常人个体，每例取Iml全血，在2小 时内分别于常温下依次进行1200gX 10分钟，15000g X 10分钟离心，取血浆。2.血浆中RNA抽提每例个体取50μ1 血浆，力卩入 750 μ 1 TRI REAGENT BD (MolecularResearchCenter公司)和20 μ 1 5Ν醋酸，混勻后加入5 μ 1浓度为50pmol/L的 Cel-miR-39,震荡混勻，室温下静置5分钟，加入200 μ 1氯仿，震荡混勻，室温下静置5分 钟，4°C，12000g离心15min，提取上清液，加入4 μ 1 DNA mate (TAKARA公司),后加入与上 清液等体积的异丙醇混勻，-20°C静置20min，4°C，12000g离心15min，去上清，向沉淀中加 入lml75%乙醇清洗沉淀，4°C，7500g离心洗涤沉淀5min。去上清，将沉淀室温晾干后加入 40 μ IRNa se-free的水充分溶解，测定所得RNA的浓度。3. RT-PCR 反应使用Applied Biosystems公司的Taqman microRNA反转录试剂盒对提取的RNA进 行反转录反应。15 μ 1反应体系中包括2μ 1提取的RNA，0. 15 μ 1的dNTPs (0. 25mM)，1 μ 1 的反转录酶(3. 33U/y 1，Ρ/Ν =4319983, AppliedBiosystems),0. 19 μ 1 的 RNase 抑制剂 (0. 25U/y 1，Ρ/Ν :Ν8080119 ；AppliedBiosystems)，1· 5μ 1 IOXRT buffer (Ρ/Ν =4319981, Applied Biosystems),7. 16 μ 1 RNase-free /K, 3 μ 1 stem-loop RT primer(50ηΜ)。使 用AppliedBiosystems公司9700热循环仪进行16°C 30分钟，42°C 30分钟，85°C 5分钟的 反转录。对反转录产物进行适当稀释后，取5 μ 1作为实时定量PCR的模板，使用Applied Biosystems 公司的 TaqMan Universal PCR Master Mix 试剂盒进行实时定量 PCR 鉴定。PCR 反应在 Applied Biosystems 7900HT 序列检测系统(P/N :4329002，Applied Biosystems) 中进行。PCR 反应体系为 20μ 1，包括 5μ 1 RT 产物，IOul 10Χ TaqMan Universal PCR Master Mix (Ρ/Ν =4324018, Applied Biosystems)，1 μ 1 TaqMan 探针(0. 2mM)， 4ylRNaSe-free水。将所有的反应体系首先进行95°C 10分钟的预热，然后进行每循环 950C 15秒，60°C 1分钟，共50循环的PCR反应。所有的反应重复三次，每次取固定的阈值， 三次测定中最少的Ct值作为该样本Ct值。4.实时定量PCR数据的标准化处理用上述方法先检测各例样本的MicroRNA-21的Ct值(Ct21)及参照物Cel-miR-39 的Ct值(Ct 39)，将所得Ct 39值减去Ct 21值，即得标准化后的表达丰度值(Δ Ct)。5. MicroRNA-21表达丰度值(Δ Ct)范围的确定通过实时定量PCR获得所有样本microRNA-21的Δ Ct值，见表1，表1. 55例样本(胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人)MicroRNA-21的Δ Ct值 进行方差分析，可见组间差异显著(ρ = 0. 009)，然后使用LSD法进行组间两两比 较，可见胰腺癌与慢性胰腺炎，胰腺癌与正常人间差异显著(P值分别为0. 034和0. 006)，而 慢性胰腺炎同正常人间没有差异(P = 0. 400)，见图1初步判定mi croRNA-21可以作为胰腺疾病良恶性的判定。然后进行ROC分析，AUC下面积为0. 719，诊断准确度为中等，取诊断界值为ACt = -1. 518，其鉴别胰腺疾病良 恶性的敏感性为71%，特异性为62. 5%，见图2。
权利要求
MicroRNA-21在鉴别胰腺癌中的应用。
全文摘要
本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种将血中的microRNA作为标志物，鉴别胰腺癌的方法。本发明通过大样本调查检测，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱，再将未知血浆标本中的microRNA-21表达丰度值ΔCt，对照上述MicroRNA-21的表达量标准图谱，如果落入胰腺癌组microRNA的范围内，则将其归为胰腺癌，如果落入慢性胰腺炎或正常人组的的范围内，则基本排除胰腺癌。本发明方法具有检测方便、准确率高等特点。
文档编号C12Q1/68GK101880707SQ20091005057
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月5日 优先权日2009年5月5日
发明者孔祥毓, 李兆申, 杜奕奇, 林寒, 王国坤, 荆清, 高军 申请人:中国人民解放军第二军医大学