专利名称：线粒体基因耳聋相关突变位点及用途的制作方法
技术领域：
本发明属基因组学领域，涉及遗传性疾病的相关基因，具体涉及线粒体基因耳聋 相关新突变位点tRNA His 12201T > C及其用途。
背景技术：
遗传性耳聋是一种严重影响生存质量的常见疾病，临床实践显示，目前尚无有效 药物与治疗方法，故预防该遗传性耳聋的发生显得至关重要。研究显示，遗传性耳聋的遗传 方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性连锁遗传和母系遗传。线粒体DNA是独立 于细胞核染色体外的基因组，仅通过女性向下一代传递，男性则不再下传。研究显示，线粒体基因突变可引起多种疾病，线粒体基因突变引起的耳聋即呈现 母系遗传的特点。1993年Prezant等发现线粒体DNAA1555G突变是导致携带此突变的个体 对氨基糖甙类抗生素高度敏感产生耳聋的主要因素，自此对母系遗传性耳聋的病因学研究 有了突破性进展。此后，研究相继发现C1494T、A7445G、7472insC、T7510C、T7511C等与耳 聋相关的线粒体DNA突变。线粒体遗传的母系遗传特性导致特定人群携带致病突变及发病，根据这一特点通 过系统的线粒体DNA突变筛查发现阳性个体并进一步对其家族中未发病的母系家庭成员 进行防聋宣教，制定预防策略，具有积极的社会意义和经济意义。
发明内容
本发明的目的是提供线粒体基因新突变及其用途，特别涉及线粒体基因耳聋相关 新突变位点12201T > C及其在线粒体基因突变导致耳聋的基因学诊断中的用途。本发明提供的线粒体基因新突变为12201T > C。12201T > C位于线粒体tRNA His (位于线粒体12138-12206)上，所述的12201由胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)。其所 在序列为 GTAAATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACGACCCCTTA￡TTAC C，具有序列1的结构。该序列为人类线粒体tRNA His基因全部序列，其中加下划线的字体 为突变位点。本发明所述的线粒体基因耳聋相关突变通过下述方法和步骤获得1.采集标本在医院就诊的门诊病人中调查获得一母系遗传性耳聋家系，进行家 系调查、病史采集、体检、测听、收集该家系成员外周静脉血，进行基因检测(经伦理委员会 批准，家系成员签署知情同意书后)；2.全基因组DNA的抽提按血液基因组DNA抽提试剂盒操作说明进行操作，试剂 盒为 PAX gene Blood DNA Kit ；3.序列分析(1)采用经典的24对线粒体引物分别进行PCR扩增，所得PCR产物片段相互重叠， 可覆盖线粒体全序列；4. PCR 扩增
PCR反应体系为30ul，含基因组DNA模板lOOng，正反向引物各3pM，10XPCR Buffer 3 ii 1 (含 Mg2+)，dNTPs 300nM, Taq lu ；扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，退火30s (引物1、23、24退火温度为 60°C，引物2、11退火温度为58°C，引物3 10、12 17、22退火温度为59. 7°C，引物18、 21退火温度为54. 8°C，引物19、20退火温度为58. 1°C, )，72°C延伸30s，30个循环后72°C 延伸7min终止反应。5. PCR产物纯化(上海英骏生物技术有限公司)后直接测序；6.测序结果用GeneTool软件与人类线粒体标准序列(经过校正的人类线粒体 DNA 剑桥参考序列，Human Mitochondrial DNA RevisedCambridge Reference Sequence) 进行比对，发现可疑的突变位点后用Chromas基因阅读软件读取测序结果的峰图文件，进 行确认或排除。同时用Chromas软件阅读全部测序峰图，以免遗漏异质性突变。7.采用GeneTool软件完成蛋白编码区上的由于碱基突变导致的氨基酸变化的分 析。8.分析线粒体DNA上的基因突变在不同物种之间的保守性首先，在NCBI的网站 (http://www.ncbi.gov/)上找至lj人的线粒体基因组序列(Homo sapiens mitochondrion, completegenome :NC 001807)、 41 白勺 _ 半立 # @ 会且 歹I」(Bos taurusmitochondrion, complete genome :NC-006853) >(Mus musculus mitochondrion, complete genome :NC_005089)和爪蟾的线粒体基因组序列(Xenopus laevis mitochondrion, completegenome :NC 001573)，然 后通过 http://www, ebi. ac. uk/ clustalw/网站对包含基因突变的序列进行比对，观察在不同物种之间的保守性。鉴于线粒体DNA tRNA His 12201T > C突变是中国耳聋患者中的新突变类型，本 发明所提供线粒体基因耳聋相关新突变可用于对线粒体相关耳聋的检测，有助于排除或诊 断线粒体基因突变相关耳聋。该线粒体基因新突变对耳聋的诊断工作提供了新位点。本发明中，采用线粒体基因12201位点突变对可疑母系遗传性耳聋进行检测，有 助于排除或诊断线粒体基因突变相关耳聋。本发明中，采用线粒体基因耳聋相关新突变制备诊断探针，引入突变造成酶切位 点的引物，通过酶切的方法，能更简便快捷的诊断线粒体相关耳聋患者是否存在该位点的突变。进一步，本发明中，按常规方法制备含有上述突变位点12201T > C的试剂盒。本发明所述的线粒体耳聋相关新突变，能对有关线粒体耳聋的基因诊断工作带来 显著的便利，所述的线粒体12201T > (突变位点在不同物种间进化高度保守，该位点的突 变能影响tRNA His的稳定性和功能，进而导致耳聋的发生。本发明所述的线粒体耳聋相关 新突变对该基因突变引起的功能改变进行下一步深入研究提供了参考依据；对揭示线粒体 DNA突变致聋的分子机制，丰富中国感音神经性聋人群线粒体DNA突变图谱提供了良好的 契机。
图1是耳聋家系图，其中该家系有近亲婚配情况存在，近亲婚配的2个子女有耳聋存在。
图2是物种间保守性分析 3 是 tRNA His 二级结构。图4为异质突变，箭头所示为发生突变的位点。图5为同质突变，箭头所示为发生突变的位点。图6为正常测序图，箭头所示为发生突变的位点。
具体实施例方式实施例1临床研究实验1.选择研究对象在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院门诊就诊的患者中获得符合母系遗传规律的耳 聋大家系。2.采集标本经伦理委员会批准、家系成员签署知情同意书后收集家系成员外周 静脉血5ml，用于基因检测。3.全基因组DNA的抽提按血液基因组DNA抽提试剂盒操作说明进行操作，试剂 盒为 PAX gene Blood DNA Kit。4.序列分析(1)采用经典的24对线粒体引物分别进行PCR扩增，所得PCR产物片段相互重叠， 可覆盖线粒体全序列；(2) PCR 扩增PCR扩增体系为30ul，含基因组DNA模板lOOng，正反向引物各3pM，10 X PCR Buffer 3 ii 1 (含 Mg2+)，dNTPs 300nM, Taq lu ；扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，退火30s (引物1、23、24退火温度为 60°C，引物2、11退火温度为58°C，引物3 10、12 17、22退火温度为59. 7°C，引物18、 21退火温度为54. 8°C，引物19、20退火温度为58. 1°C, )，72°C延伸30s，30个循环后72°C 延伸7min终止反应。(3)PCR产物送上海英骏生物技术有限公司纯化后直接测序；(4)测序结果使用GeneTool软件与人类线粒体标准序列(经过校正的人类线粒体 DNA 剑桥参考序列，Human Mitochondrial DNARevised Cambridge Reference Sequence) 进行比对，发现可疑的突变位点后用Chromas基因阅读软件读取测序结果的峰图文件，进 行确认或排除。同时用Chromas软件阅读全部测序峰图，以免遗漏异质性突变；5.蛋白编码区上的由于碱基突变导致的氨基酸变化的分析使用GeneTool软件来 完成。6.线粒体DNA上的基因突变在不同物种之间的保守性分析首先，在NCBI的网站 (http://www.ncbi.gov/)上找至lj人的线粒体基因组序列(Homo sapiens mitochondrion, completegenome :NC-001807)、 41 的 _ 半立 # @ 会且 歹I」(Bos taurusmitochondrion, complete genome :NC-006853) >(Mus musculus mitochondrion, complete genome :NC_005089)和爪蟾的线粒体基因组序列(Xenopus laevis mitochondrion, completegenome :NC_001573)，然后 通过 http://www, ebi. ac. uk/ clustalw/网站对包含基因突变的序列进行比对，观察在不同物种之间的保守性。
结果显示，该耳聋家系母系成员线粒体基因存在tRNA His 12201!~>(突变，在 听力正常的100人正常对照中未发现该突变的存在。该突变经在MIOMAP(http //www. mitomap. orfi)、mtDB (http: //www. Renpat. uu. se/mtDB/index, html)、Pubmed、google 等 检索均未见报道，经物种进化分析在物种间进化高度保守。线粒体12201位点位于tRNA His的接受臂，而接受臂对于每一种tRNA是特异性的，作用重要，因此该位点的突变会导致 tRNA His的功能发生明显的变化，从而导致耳聋。线粒体基因耳聋相关新突变及用途序列SEQUENCE LISTING<110>复旦大学附属眼耳鼻喉科医院<120>线粒体基因耳聋相关突变位点及用途<130>12<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211 >69<212>DNA<213> 人体<400>1gtaaatatag tttaaccaaa acatcagatt gtgaatctga caacagaggc ttacgacccc 60ttacttacc69
权利要求
线粒体基因耳聋相关突变位点，其特征是，所述的突变位点是线粒体DNA tRNA His 12201T＞C突变。
2.按权利要求1所述的线粒体基因耳聋相关突变位点，其特征是，所述的突变位点中， 12201T > C位于线粒体tRNA His 12138-12206，12201由胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)。
3.按权利要求1所述的线粒体基因耳聋相关突变位点，其特征是所述的12201T> C， 其所在序列具有序列1的结构。
4.按权利要求1所述的线粒体基因耳聋相关突变位点，其特征是所述的位点在各物种 间进化高度保守。
5.一种诊断探针，其特征是含有权利要求1所述的线粒体基因耳聋相关突变12201T >C0
6.一种引入突变造成酶切位点的引物，其特征是通过酶切的方法检测权利要求1所述 的突变。
7.一种试剂盒，其特征是含有权利要求1所述的线粒体基因耳聋相关突变12201T >C0
8.权利要求1所述的线粒体基因耳聋相关突变12201T> C在制备诊断耳聋诊断试剂 中的用途。
全文摘要
本发明属基因组学领域，具体涉及线粒体基因耳聋相关突变12201T＞C及用途。本发明的线粒体基因耳聋相关新突变12201T＞C所在序列具有序列1的结构。本发明可采用线粒体基因耳聋相关新突变对耳聋患者进行线粒体突变位点优先检测，有助于排除或诊断线粒体基因突变导致的耳聋；可采用线粒体基因耳聋相关新突变制备诊断探针、引入突变造成酶切位点的引物和试剂盒，能简便快捷的进行线粒体相关耳聋的筛查。本发明为深入研究该基因突变引起的功能改变提供了参考依据；为揭示线粒体DNA突变致聋的分子机制提供良好的契机。
文档编号C12N15/12GK101875938SQ20091005022
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者严旭坤, 何英姿, 孙明之, 孙珊, 李华伟, 李庆忠, 王正敏, 陈帼玲 申请人:复旦大学附属眼耳鼻喉科医院