一种新型线粒体基因组编辑工具的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因组工程领域，具体地说，涉及一种新型线粒体基因组编辑工具。
【背景技术】
[0002] 随着测序技术的不断发展，我们从中获得了越来越多的遗传信息。但如此庞大的 信息又该如何应用？研究人员试图通过对特定靶向基因的破坏或敲除，来研究它们的相 关功能，而实现这一目的的技术称为基因组编辑技术。此外，该技术还可应用于疾病的治 疗和预防。目前，常用的基因组编辑技术主要包括以下三种：锌指蛋白技术（Zinc Finger Proteins，ZFPs)、转录激活因子样效应因子（Transcription activator-like effectors， TALEs)技术、CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 技术。它们的大致原理都是通过对革巴向DNA造成双链断裂（Double strand breaks，DSBs)， 进而引发细胞内固有的非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组 (homologous recombination，HR)两种修复机制对断裂处进行修复。其中，易出错的NHEJ 可以在DSBs处引入插入或缺失突变，这种突变不可人为控制。另一种修复机制HR，通过提 供的单链或双链寡核苷酸模板对DSBs处进行精确修复，可人为控制。三种技术在作用机制 与具体操作方式上又有所不同：
[0003] 锌指核酸酶（zinc-finger nuclease, ZFN)与转录激活子样效应因子核酸酶 (tran-scription activator-like effector nulease，TALEN)这两种人工核酸内切酶，都 是通过DNA识别域与非特异性核酸内切酶FokI融合而成。其中，ZFN的锌指模块识别三联 体碱基，序列识别上灵活性小、设计成本昂贵等问题都限制了它的发展。随后出现的TALEN 在结构上较之ZFN更加优化，其DNA结合域中的各单元与靶向DNA序列--对应,组装更 为简单，特异性也更高，并于2012年被《Science》评为年度十大科技突破之一。2013年， 一种源自细菌适应性免疫系统，由RNA介导Cas9蛋白剪切的全新基因组编辑技术CRISPR/ Cas9系统出现，在全球刮起了一阵CRISPR旋风，并被《Science》评为2013年度十大科技突 破之一。较之ZFN、TALEN，CRISPR/Cas9系统在构建上更为简单，且成本低、作用效率高，极 易广泛普及。经过近两年的发展，现已成功用于细菌、酵母、线虫以及多种模式动物、模式植 物中，同时区别于ZFN、TALEN，成功的实现了对RNA的剪切编辑。作为新型的基因组编辑技 术，为靶向突变目的基因，研究靶向基因间的相互作用，以及人类遗传疾病的最终治疗提供 了强大的技术支持。
[0004] 目前来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes)，经人工改造后的CRISPR/Cas9 系统应用最广泛。其作用机制如下：首先，gRNA与Cas9蛋白形成的复合物在间隔序列 (spacer)的指导下，与革巴向序列结合。间隔序列一般为20bp，革巴向DNA与之同源的序列称 为原型间隔区（protospacer)。紧邻原型间隔区的下游，存在一小段序列，即原型间隔序 列相邻基序（Protospacer adiacent motifs，PAM)。PAM -般为2-5个喊基，且来自不同 物种的CRISPR/Cas系统，其PAM不同。化脓链球菌中的PAM为NGG，N为任意碱基。因此， CRISPR/Cas9系统的特异性由20bp的原型间隔区和3bp的PAM共同决定。接着，识别靶向 序列后，通过Cas9核酸酶进行剪切。Cas9蛋白存在两个核酸功能域，即RuvC-like和HNH。 RuvC-like结构域剪切原型间隔区所在单链，B卩非互补链（Non-complementary)，作用位置 为PAM上游3-8nt处。而HNH结构域剪切另一条单链，B卩互补链（complementary)，作用位 置为PAM上游3nt处。两个结构域共同作用，在靶向位置处产生DSBs，进而引发细胞内的固 有修复机制（NHEJ、HR)，对DNA损伤部分进行修复，从而引入突变（如图1所示）。
[0005] 线粒体是存在于大多数真核生物（包括植物、动物、真菌和原生生物）细胞中的细 胞器，有"细胞中的能量工厂"之称。它主要通过氧化磷酸化以三羧酸循环腺苷（ATP)的形 式为细胞活动提供能量。同时，还参与诸如铁硫簇的生物合成、钙稳态调节、细胞分化、细胞 信息传递和细胞凋亡等过程，并且拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
[0006] 线粒体基因组，又称线粒体DNA(mtDNA)。长度一般为几万至数十万碱基对，人类 mtDNA为16, 569bps，共编码2个rRNA、13个mRNA、22个tRNA。基因排列紧凑，除与mtDNA 复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。mtDNA表现为母系遗传，突变率高，是细胞 核内DNA的10倍左右。且mtDNA突变是导致人类线粒体遗传病及衰老性疾病的重要原因。 研究表明，它与衰老及神经退行性病变如阿尔茨海默症、帕金森氏病等老年化疾病有关，同 时也与肿瘤的形成密切相关。截至目前，已鉴定出超过500多个致病性突变来自mtDNA。而 因缺乏对mtDNA相关序列的精确改造能力，现在对于这类疾病的治疗仍无有效手段。
[0007] 本发明，是继 Michal Minczuk 等将 ZFN 运用于 mtDNA 编辑（Michal Minczuk et al.，2006)及 Sandra R Bacman 等将 TALEN 首次作用于 mtDNA (Sandra R Bacman et al.， 2013)后，基于人工改造的CRISPR/Cas9系统的一种新型线粒体基因组编辑工具。迄今为 止，国内外还未有报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于，提供一种高效、精确的线粒体基因组编辑工具。
[0009] 本发明基于对CRISPR/Cas9系统的改造，进而实现了对线粒体靶向基因的高效、 精确编辑。该系统主要包括两部分：进入线粒体的向导RNA(mt-guide RNA，mt-gRNA)和定 位于线粒体的Cas9核酸酶（mito Cas9, mtCas9)。
[0010] 所述进入线粒体的向导RNA包括以下两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶向目 标序列（Target sequence)和gRNA骨架（gRNA scaffold)序列三部分组成的RNA(如图2A 所示）；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列（Geng Wang et al.，2012)或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列四部分组成的RNA(如图 2B、2C 所示）。
[0011] 所述进入线粒体的向导RNA，其RNA线粒体定位引导序列可以为RP(RNase P，RP) 序列（Geng Wang et al. ,2010)，也可以是其他能够跨膜进入线粒体基质内，并能引导gRNA 进入线粒体的序列。
[0012] 所述编码第一种mt-gRNA的DNA序列，以RP序列作为RNA线粒体定位引导序列为 例，可通过两条带有RP序列和靶向目标序列的互补寡核苷酸链经退火后，由Bbsl限制性酶 切位点或其它合适的限制性酶切位（如Bsal)连入编码gRNA骨架的DNA片段中。相应互 补寡核苷酸链结构如下：
[0013] CACCGTCTCCCTGAGCTTCAGGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3, lllllllllllllllllllllllll llllllllll III CAGAGGGACTCGAAGTCCCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5,
[0014] 其中，CACC、CAAA为Bbsl (或者Bsal)酶切后产生的连入载体所需粘性末端；编码 RP序列的核苷酸序列为：TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG ;N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段 靶向目标序列。
[0015] 所述编码第二种mt-gRNA的DNA序列，编码以RP序列为例的RNA线粒体定位引导 序列、线粒体编码的任意一种tRNA (22种）序列、靶向目标序列的DNA片段。通过一对含RP 序列的正向引物和含靶向目标序列的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由Bbsl限制性酶 切位点或其它合适的限制性酶切位点（如Bsal)连入编码gRNA骨架的DNA片段中。以线 粒体编码的tRNA-Leul为例：
[0016] 正向序列 F-Leul:
[0017] 5，-CAGAAGACCTCACCATGTCTCCCTGAGCTTCAGGGAGGGAGAAATAAGGCCTACTTCAC-3，
[0018] 反向序列 R-Leul:
[0019] 5, -CAGAAGACCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGTTCGGTAAGCATTAGG-3,
[0020] 其中，横线部分为Bbsl限制性酶切位点；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸 序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
[0021] 所述靶向目标序列，为mtDNA中的任意一段目标核苷酸序列。其结构如下： 5' -Nx-NGG-3'，其中N为A、C、G、T任意碱基，16彡X彡30,且X-般为20。
[0022] 所述 gRNA 骨架，由反式激活 CRISPR RNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA)、 CRISPR RNA(crRNA)嵌合结构，优化融合为一条单链RNA后所得。其中，类似发夹结构的RNA 部分，用以招募Cas9核酸酶。这个复合体在gRNA的指导下，通过Cas9蛋白两个核酸功能 域：RuvC-1 ike和HNH，对靶向位置的DNA双链进行剪切，造成DSBs。
[0023] 所述两种mt-gRNA的转录均由U6启动子启动，U6启动子与编码gRNA骨架DNA片 段的核苷酸序列中间插入两个Bbsl限制性酶切位点，用以同时连入编码RNA线粒体定位引 导序列、靶向目标序列的DNA片段或编码RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一 种tRNA序列或其他额外间隔序列、靶向目标序列的DNA片段中任意一种结构，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。其中，U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中第