专利名称：一种检测线粒体基因单倍型类群的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用寡核苷酸探针的新型人类线粒体基 因(mitochondrial DNA, mtDNA)单倍型类群分型方法，能够利用相对微量的mtDNA模板， 确定样本的mtDNA单倍型类群，包括目标人群主要mtDNA单倍型类群及其常见亚型。
背景技术：
人类mtDNA呈严格的母系遗传，缺乏重组，有效群体仅为核DNA的1/4，突变率为 核DNA的10倍以上，这些特点使其成为研究人类系统进化、人群历史迁移的有效的遗传标 记。从上世纪80年代到现在，对mtDNA序列的系统分析结果较好地阐明了现代人类的起 源、迁徙路线、人群历史动态、不同群体间的遗传关系、法医学个体身份确定等问题。各大 洲人群mtDNA变异主要体现在一些由系统发育上构成单系的一组mtDNA世系(1 ineage, haplotype),即单倍型类群(haplogroup)的分布上，而每种单倍型类群又都有一些特征位 点变异，这些位点在mtDNA编码区和控制区序列中都有体现。基于标准序列，即修正剑桥标 准序列，通过对mtDNA多态性的分析，根据特定的变异来确定单倍型类群的分类标准。目前 已建立了非洲、欧洲、亚洲等不同种族人群的单倍型分型树，并处于不断的完善升级中。对 于需应用mtDNA单倍型概念来作为分类标准的研究，则可根据已有各自种群的分型树，通 过分析某个体的mtDNA多态性，来确定该个体属于哪一个具体的单倍型类群。理论上讲，一切能够检测突变多态的方法都可应用于mtDNA的研究，目前应用较 多的主要是限制性酶切和直接测序，具体包括限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、控制区序列测序分析、D-loop序列分析结合 RFLP、全序列测序分析等。限制性酶切结合RFLP的方法指的是基于剑桥标准序列设计一系列引物扩增特定 区段，进而进行酶切，通过酶切后限制性片段的多态性来反映mtDNA的变异。这是最经典， 应用最早的mtDNA变异检测手段，也被证明是一种行之有效的方法，特别是在改进了引物 设计，形成所谓的高分辨率RFLP方法之后，目前仍广泛应用于mtDNA单倍型分型的研究中。 但这种方法也有其明显的局限性部分限制性内切酶的价格较高；不同限制性内切酶的反 应体系条件不尽相同，一次电泳检测的样本数有限，工作量大；限制性内切酶识别的位点有 限，有些重要的位点无法识别，检测效率低；RFLP易出现非特异性条带，影响分辨率，分析 对经验要求较高。这些局限性影响了这个方法的使用，特别是在进行较大样本研究时。测序分析也是目前应用较多的mtDNA单倍型类群分型手段，包括控制区序列测序 分析和全序列测序分析。由于mtDNA的基因具有很大的简约性和经济性，非编码序列比较 少，而处于mtDNA复制控制区的长度约为1122bp的序列不编码蛋白质，在进化过程中选择 压力相对较小，因而具有较其他区域更多的多态性。研究也表明，D-Ioop的突变速率总体上 约为整个序列的10倍。在控制区序列中，大多数突变都发生在两段长度约为300-400bp的 区域，被统称为第1高变区(hypervariable segment I，HVS I )和第2高变区(HSV II )。 目前，大多数对于D-Ioop序列的测定都集中在这两个区域。显然对于高变区序列的测序可以获得大量的信息，但由于该区域本身为突变热点区，不够稳定，所以特异性尚显不够。全 序列测序理论上讲是最好的方法，但进行mtDNA全序列测序的代价、工作量、技术要求等都 比较高，难以推广和应用于大样本研究。因此有学者采用D-Ioop序列分析结合RFLP的方 法，来减少这两种方法的局限性，但RFLP在应用于大样本研究时，工作量仍较大。实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)的出现，为高效快速检测单核苷酸突变提供了途径。通过建立mtDNA高变区序列测序 分析结合mtDNA编码区序列特定位点验证的模式，以寡核苷酸探针real-time PCR来代替 传统的RFLP，可以建立一种快速、高效、可靠的mtDNA单倍型分型策略和检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测线粒体基因单倍型类群的方法，是利用寡核苷酸探 针组检测mtDNA单倍型类群特征性位点的方法。采用Mx3005P Real-time PCR Allele Discrimination-SNP's模式，以FAM、HEX荧光信号为检测信号。通过机器对FAM荧光信号 的判定来检测特定的mtDNA突变，具体操作步骤如下
(1)筛选出主要线粒体基因(mtDNA)单倍型类群及其主要亚型或任意目的单倍型的特 征性位点，根据突变位点设计寡核苷酸探针及目的片段的上下游引物序列(东亚人群主要 mtDNA单倍型类群特征性位点探针见附表1)；
(2)确定最佳定量(Real-time)PCR反应体系体系总体积为25 μ 1，其中含DNA模板 2μ 1 (含至少8ng全基因组DNA)，目的片段的相应上下游引物各1. 125μ 1 (10nM)，FAM荧 光标记探针0. 625 μ 1 (IOnM), PCR反应Mix液12. 5 μ 1和超纯水7. 625 μ 1 ；
(3)确定最佳Real-timePCR扩增曲线50°C 2分钟，95°C 15分钟，40个循环扩增， 每个循环包含以下过程95°C 30秒，再60°C 45秒，再72°C 1分钟。(4)检测设定Real-time PCR系统信号起跳的阈值，根据信号是否起跳，扩增曲 线图形等综合判定结果，系统将自动生成检测结果及相关详细数据列表，并可提供直观的 散点图进一步说明检测结果。本发明的另一个目的是提供所述检测方法在确定任意个体mtDNA单倍型类群中 的应用。本发明的有益效果是
(1)本发明方法设计合理，建立了一种新型的利用寡核苷酸探针的mtDNA单倍型类群 分型方法；
(2)快速、廉价、准确的进行mtDNA单倍型类群分型，尤其适用于较大样本量的分析；
(3)相比较于RFLP传统方法，本发明设计的方法不受特定位点(如限制性内切酶位点) 限制，可以对任意单倍型类群特征性位点进行检测。(4)本发明利用了目前成熟的Real-time PCR技术，不仅高效快捷，且灵敏度高，对 检测样本的核酸模板要求低，在法医学、考古学等领域的应用具有较大优势。
图1为本发明探针检测结果输出示例扩增曲线图。图2为本发明探针检测结果输出示例散点图。图3是对探针检测结果的RFLP验证示例图。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一本发明寡核苷酸探针组的制备和反应体系建立 1，东亚人群mtDNA单倍型类群寡核苷酸探针组的制备
根据东亚人群mtDNA单倍型类群分型树筛选出11个mtDNA编码区特征性位点(参见表 1)，涵盖了东亚人群主要mtDNA单倍型类群及其主要亚型，根据所需检测的位点设计寡核 苷酸探针。由于mtDNA突变频率高，因而在设计探针时需避免探针序列中包含常见的高突 变位点。然后再利用引物设计软件primer premierf. 0设计包含了所需检测位点基因片段 的上下游引物。探针及引物均交由上海Genecore生物工程有限公司合成。制备完成的引物 及探针浓度均为 20nM/L。PCR 反应液成分Tris-HCl PH8. 5 20mM ；KCl IOOnM ；MgCl2 3nM ； dNTP400nM ；Taq酶200U制备完成的引物探针及PCRMix液_20°C保存备用。2，Real-timePCR 和数据分析
Real-timePCR过程反应体系控制上下游引物浓度为10nM，FAM探针浓度为ΙΟηΜ，至 少加入8ng全基因组DNA模板。利用以下扩增曲线进行RCP反应50°C 2分钟，95°C 15 分钟，40-50循环扩增，每个循环包含以下过程95°C 30秒，再60°C 45秒，再72°C 1分钟。 根据机器输出的扩增曲线、数据列表及散点图等进行结果判定。(参见图1和图2 ) 实施例二本发明设计的寡核苷探针分型法的重复性和准确性 预实验设计东亚人群mtDNA单倍型类群相关11组寡核苷酸探针，对70例正常人群进 行mtDNA单倍型类群分析，重复测定两次，结果显示重复测定结果均一致，主要分型结果 如下F型17例，B型8例，N9型1例，A型7例，D型16例，G型4例，M7型7例，M8型6 例，M9型4例。独立实验者采用RFLP方法对上述70例样本进行mtDNA单倍型类群分型， 所有结果均与探针法结果相符合。对于同一个体标本的重复检测获得相同的结果说明该方 法具有良好的重复性，而通过将该方法检测的结果与经典的RFLP方法检测的结果的比较 充分证明该方法的准确性(参见图3)，能够用于后续分析。图3中a 对mtDNA单倍型类群 A的验证结果；b 对mtDNA单倍型类群D的验证结果；c 对mtDNA单倍型类群M7的验证结 果；d 对mtDNA单倍型类群M9的验证结果。实施例三对健康人群的检测
利用设计的东亚人群mtDNA单倍型类群相关寡核苷酸探针，共完成了 570例健康志愿 者(浙江省)的mtDNA单倍型类群的分型。分布情况如下F型101例，B型101例，R型(不 包括F型及B型)9例，N9型25例，A型43例，D型140例，G型19例，M7型51例，M8型 45例，M9型17例，其他型19例。独立实验者随机选取其中10%样本采用RFLP方法进行 mtDNA单倍型类群分型，结果均与探针法相符。本结果中提示东亚人群主要mtDNA单倍型类 群M、N、R在人群中的分布率分别为47. 7%,48. 9%、37%，分布率与已知文献报道的相同人群 的mtDNA单倍型类群分布率相似。本次实验再次提示了本发明所设计的mtDNA单倍型类群 分型方法可快速、廉价、准确的进行mtDNA单倍型类群分型。
实施例四对脓毒血症患者中高危人群的筛查
利用设计的东亚人群mtDNA单倍型类群相关寡核苷酸探针对181例重症脓毒血症的患 者的mtDNA单倍型类群进行分型，并对这些患者的预后和mtDNA单倍型类群的关系进行分析。患者mtDNA单倍型类群分布情况如下F型31例，B型35例，R型66例，N9型8例，A 型18例，D型42例，G型5例，M7型21例，M8型13例，M9型4例，其他型4例。再从患者中 随机选取其中10%样本采用RFLP方法进行mtDNA单倍型类群分型，结果均与探针法相符。 结果还显示汉族人群中，mtDNA单倍型类群R为重度脓毒血症预后的一个独立预测因素，具 有此种mtDNA单倍型类群的个体比非R型个体有较好的180天生存率。本次实验再次提 示了本发明所设计的mtDNA单倍型类群分型方法可快速、廉价、准确的进行mtDNA单倍型类 群分型。而且利用这一方法可以对重症脓毒血症患者进行mtDNA单倍型类群快速分型，有 助于对患者预后的判断。东亚人群主要mtDNA单倍型类群相关寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO. Γ33 所示。表1东亚人群主要mtDNA单倍型类群相关寡核苷酸探针
权利要求
1.一种检测线粒体基因单倍型类群的方法，通过以下步骤实现(1)筛选出主要线粒体基因单倍型类群及其主要亚型或任意目的单倍型的特征性位 点，根据突变位点设计寡核苷酸探针及目的片段的上下游引物序列；(2)确定最佳PCR反应体系体系总体积为25μ 1，其中含DNA模板2 μ 1，目的片段的 相应上下游引物各1. 125 μ 1，FAM荧光标记探针0. 625 μ 1，PCR反应液12. 5 μ 1和超纯水 7. 625μ 1 ；(3)确定定量PCR扩增曲线50°C2分钟，95°C 15分钟，40个循环扩增，每个循环包 含以下过程95°C 30秒，再60°C 45秒，再72°C 1分钟；(4)检测设定定量PCR系统信号起跳的阈值，根据信号是否起跳，扩增曲线图形综合 判定结果，系统将自动生成检测结果及相关详细数据列表，并提供直观的散点图进一步说 明检测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)筛选出东亚人群11个mtDNA编 码区特征性位点，并设计相应目的片段的上下游引物序列，具体为SEQ ID NO.广33所示的 基因序列。
3.根据权利要求1所述的方法在确定任意个体线粒体基因单倍型类群中的应用。
全文摘要
本发明提供一种检测线粒体基因单倍型类群的方法，是利用寡核苷酸探针组检测mtDNA单倍型类群特征性位点的方法。采用Mx3005PReal-timePCRAlleleDiscrimination-SNP’s模式，以FAM、HEX荧光信号为检测信号，通过对FAM荧光信号的判定来检测特定的mtDNA突变。本发明方法设计合理，可快速、廉价、准确的进行mtDNA单倍型类群分型，尤其适用于较大样本量的分析；本发明设计的方法不受特定位点限制，可以对任意单倍型类群特征性位点进行检测。本发明方法可在确定任意个体mtDNA单倍型类群中的应用尤其对检测样本的核酸模板要求低，在法医学、考古学等领域的应用具有较大优势。
文档编号C12Q1/68GK102127602SQ20101060617
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者张萍, 杨毅, 陈江华 申请人:浙江大学