拟南芥线粒体丙酮酸转运体基因AtMPC1在植物抗干旱胁迫中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及拟南芥线粒体丙酬酸转运体基因，尤其设及拟南芥线粒体丙酬酸转运 体基因AtMPCl(GeneID: 832131)在调控气孔运动及植物抗干旱胁迫中的应用，属于基因工 程领域。
【背景技术】
[0002] 线粒体丙酬酸转运体（MPC)定位于线粒体内膜，可W跨膜转运胞质内糖酵解产物 丙酬酸进入线粒体内部进行S簇酸循环（TCA)。丙酬酸是生物体内重要的中间代谢产物，参 与糖、脂肪、氨基酸等代谢过程。因此，对丙酬酸转运体编码基因的克隆和功能分析在基因 工程方面具有重要的潜在应用价值。 阳00引通过生物信息学对已公布的AtMPCl基因序列（Gene10:832131)分析，表明其编 码蛋白含有丙酬酸转运体保守的结构域一UPF0041，但是在植物中其生物学功能还没有研 究报道。另外，生物信息学分析表明AtMPCl在拟南芥保卫细胞中大量表达，经检索，针对其 是否参与气孔运动及植物抗干旱响应方面还没有相关应用报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有研究内容的不足，本发明的目的是提供一种拟南芥线粒体丙酬酸转运体 基因AtMPCl在调控气孔运动及植物抗干旱胁迫中的应用。 阳0化]本发明所述拟南芥线粒体丙酬酸转运体基因AtMPCl在调控气孔运动及植物抗干 旱胁迫中的应用。
[0006] 其中：所述拟南芥线粒体丙酬酸转运体基因AtMPC1的序列已公布，见Gene 10:832131 ;所述植物是十字花科植物，所述十字花科植物指拟南芥。
[0007] 申请人首先利用酵母功能恢复实验，证明AtMPCl编码具有丙酬酸转运体活性的 蛋白（如图1所示）。之后，Wmpcl(Salk-008945C)缺失表达突变体为实验对象，W野生型 植株（Co^O)为对照，发现突变体对脱落酸（ABA)促进气孔关闭过程更敏感，叶片失水率更 低。并且，植物的抗干旱能力增强（结果如图2,3,4所示）。
[0008] 基于上述结果，本发明公开并确认了植物中具有丙酬酸转运体活性的编码基因 AtMPCl在调控气孔运动及植物抗干旱胁迫中的应用。实验证实，AtMPCl可W调控气孔运 动，进而影响植物的抗逆能力。运有望在农作物品种改良W及作物产量或品质提升上提供 帮助和支持，对农业生产及技术推广具有重要意义。
【附图说明】 阳009] 图1=AtMPCl编码具有丙酬酸转运体活性的蛋白。
[0010] 其中：A:当酵母缺失MPCl蛋白功能后（mpclA)，无法在缺少亮氨酸的培养基 (SC-Leu)上生长（如图I-A所不）D
[0011] B:当mpclA转入获得AtMPCl基因后，能够恢复成野生型的表型，在SC-Leu培养 基中正常生长（如图I-B所示）。
[0012] W上结果表明AtMPCl编码具有丙酬酸转运体活性的蛋白。
[0013] 图2 :mpcl突变体对ABA促进气孔关闭过程过敏感。
[0014] 其中：A:mpcl突变体与野生型（Co^O)的气孔运动柱形统计图。 阳01引 B:mpcl突变体与野生型（Co^O)的气孔示意图。
[0016] 结果显示，AtMPCl参与ABA调控气孔运动过程。mpcl突变体与野生型（Co^O)相 比，在对照条件下（Control)，两者的气孔开度一致；但在外源50yMABA处理下，mpcl的 气孔开度比Col-O要小（如图2-B所示）。因此，AtMPCl功能的缺失，导致对ABA促进气孔 运动过程过敏感，胁迫条件下气孔开度更小。
[0017] 图3 :mpcl突变体离体叶片失水率降低。
[0018] 离体叶片失水结果表明，同样的条件下，mpcl的叶片失水率比Col-O要低（如图3 所示），有效保持体内的水分。
[0019] 图4 :mpcl突变体抗干旱能力提高。
[0020] 其中：干旱前mpcl突变体与野生型（Col-O)长势一致。干旱两周左右后，突变体 萎黨，野生型萎黨程度更加严重。复水=天后，突变体基本恢复，野生型基本死亡。
[0021] 干旱胁迫条件下，mpcl的抗干旱能力强于Co^O,存活率更高（如图4所示），说明 AtMPCl基因参与植物干旱胁迫应答过程，在发掘和培育抗旱耐逆作为新品种中有重要的应 用潜质。
【具体实施方式】
[0022] W下实施例用于阐明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实例中未注明具 体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照产品制造生产厂商的使用说明。
[0023] 实施例1AtMPCl编码蛋白功能验证
[0024] 1，构建酵母表达载体pRS416-AtMPCl
[00巧]W拟南芥总RNA反转录获得的CDNA为模板，W下面引物组合进行AtMPCl基因序 列克隆：
[0026] MPCl-F: 5，-TAGGATCCATGGCTACATCAAGGTTCCA-3 '
[0027] MPC1-R:5> -GTGTCGACTTACTGAGATGGTTTCTCCT-3'
[0028] PCR产物电泳检测，切胶回收目的条带。纯化后的AtMPCl基因片段连接中间克隆 载体Blunt(北京全式金公司产品），转化大肠杆菌畑5a，通过抗生素筛选和菌落PCR得到 阳性克隆；连接后的Blunt载体进行测序，获得测序完全正确的AtMPCl基因序列。 阳0巧]通过酶切组合BamHI/AccI将AtMPCl基因序列从Blunt载体中切下，再次胶回 收并连接到酵母表达载体PRS416中。
[0030] 2,酵母转化及生长验证 阳03U 载体PRS416 (空载体对照，EV)、pRS416-AtMPCl通过阳G/LiAC介导的方法转化野 生型酵母菌株（WT，JRY472-W303aMAhhis31eu2metl5付plura3)和酵母突变体mpclA。
[0032] 分别在不同的营养缺陷培养基上进行酵母生长验证，如图1所示。
[0033] 结果表明酵母突变体mpclA在缺少亮氨酸的培养基上（SC-Leu)不能生长，但转 化获得AtMPCl基因后，恢复和野生型一样的表型（如图I-B所示），说明AtMPCl编码具有 丙酬酸转运体活性的蛋白。
[0034] 实施例2拟南芥丙酬酸转运体基因AtMPCl功能缺失突变体的获得和分子鉴定 阳03引1，订购T-DNA插入突变体
[0036] 通过拟南芥生物信息学网站TAIR化ttp://www.ar油idopsis.org/)，查询 AtMPClT-DNA插入突变体mpcl(Sa化-008945C)。
[0037] 2，PCR方法筛选纯系T-DNA插入突变体 阳03引生长2-3周的拟南芥幼苗，提取基因组DNA，W此为模板进行PCR检测。
[0039]TPS法提取DNA: W40] 1)用剪刀剪取l-2mm2大小的幼嫩叶片直接放入20y1的TPS缓冲液中； W41]。在200y1的Tip管中把叶片充分娠磨；
[0042] 3)娠磨后放入95°C中15分钟，然后迅速放入冰中冷却； 阳0创4)冷却后加180y1的d地2〇到Tip管中，放置4°C冰箱，基因组DNA溶解于上清 中，可直接做PCR反应模板。
[0044]TPS配方（20ml):
[0045] 母液 使用量 1MTris-HCl(pH8.0) 2nil 0.5MEDTA(pH8.0) 0.4ml IMKCi 6.67ml
[0046] 用(1地2〇定容到20ml即可。
[0047]PCR方法应用S对引物法，即T-DNA插入左侧引物（L巧和中间引物，右侧引物 触）和中间引物，左侧引物（L巧和右侧引物触）。 W48] mpcUSa化-008945C)使用的引物序列分别是
[0049]mpcI-LP :5，-AGGCAAACCTCATGAACAATG-3，， 阳0加]mpcl-RP:5, -TTTTCGCTTCTTGAAAATTGC-3,，
[0051] LBbl. 3:5>-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3> ;
[0052] 纯系植株的鉴别方法：LP+RP没有扩增条带，LP+中间引物或/和RP+中间引物有 扩出条带，说明为纯系插入。
[0053] 通过此方法筛选到两个突变体的纯系插入。
[0054] 3, RT-PCR方法鉴定AtMPCl突变体基因表达水平 阳化日]筛选到T-DNA纯系插入突变体后，RT-PCR进行RNA表达水平的检测，证明为有效 突变。
[0056] 首先提取突变体总RNA，反转录后得到的CDNA为模板进行RT-PCR检测。
[0057] RT-PCR所用到的上游引物和下游引物分别是：
[0058] RT-PCR-LP : 5'-ATGGCTACATCAAGGTTCCA-3'
[0059] RT-PCR-RP : 5'-TTACTGAGATGGTTTCTCCT-3'
[0060] 结果证明AtMPCl在突变体中没有表达，为有效的缺失表达突变体。
[0061] 实施例3拟南芥丙酬酸转运体基因AtMPCl的生物学功能应用
[0062] I，拟南芥气孔运动实验
[0063] 本操作W野生型植株（Col-O)、mpcl突变体四周左右莲座叶为操作对象，分别设 定对照组（加等体积无水乙醇处理）和实验组（加不同浓度ABA处理）。
[0064] 1)剪取生长四周的拟南芥莲座叶，放在ClosureBuffer中，下表皮接触Buffer， 室溫光照培养； 阳0化]2) 2. 5小时后，加ABA到ClosureBuffer中，终浓度为50yM，继续光照处理；
[0066] 3) 2. 5小时后，撕取叶片下表皮，制作水压片，显微镜400放大倍数下拍照； 阳067] 4)用统计软件ImageJ统计气孔开度。
[0068] 结果表明AtMPCl功能的缺失，对ABA促进气孔关闭过程过敏感，起到一个负调控 因子的作用。而野生型（Co^O)在ABA处理条件下，气孔关闭程度不如突变体大（如图2 所示）。
[0069] 2,拟南芥离体叶片失水率实验
[0070] 本操作W野生型植株（Col-O)、mpcl突变体植株为操作对象。
[0071] 生长四周左右的植株，选取生长健壮的莲座叶，剪取，放在溫室条件下进行失水实 验，分别在〇、〇. 5、1、2、3小时称量叶片重量，按照下面公式计算叶片失水率：
[0072] 叶片失水率％ = (0小时重量-X小时重量）/0小时重量X100
[0073] 离体叶片失水结果表明，同样的条件下，mpcl的叶片失水率比野生型（Col-O)要 低（如图3所示）。 阳074] 3,拟南芥植株干旱实验 阳0巧]本操作W野生型植株（Col-O)、mpcl突变体植株为操作对象。
[0076] 生长3-4周的植株，充分诱水后，停止诱水。在溫室干旱处理，一般干旱10-20天 后进行复水（根据苗子状态而定复水时间），在干旱前，干旱处理后和复水3天后分别拍照 (结果如图4所示）。
[0077] 干旱实验结果表明：同样干旱条件下，野生型基本萎黨死亡，而mpcl生长状态优 于野生型，具有更强的抗干旱能力。
[0078] 基于上述实验，本发明公开并确认了拟南芥中具有丙酬酸转运体活性的编码基因 AtMPCl在调控气孔运动及植物抗干旱胁迫中的应用。实验证实，AtMPCl编码具有线粒体丙 酬酸转运体活性的蛋白，在ABA促进气孔关闭和植物干旱应答过程起到负调控因子作用。 其缺失表达突变体mpcl在干旱条件下散失水分更慢，提高了植株整体的抗干旱能力。进而 可知，AtMPCl在调控气孔运动和植物干旱响应方面有重要的应用价值。运对于改变作物品 质，提高植物抗逆能力提供了帮助和支持。
【主权项】
1. 拟南芥线粒体丙酮酸转运体基因AtMPCl在调控气孔运动及植物抗干旱胁迫中的应 用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥。
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥线粒体丙酮酸转运体基因AtMPC1在调控气孔运动及植物抗干旱胁迫中的应用。实验证实：其突变体mpc1在气孔运动中，表现为对脱落酸(ABA)较野生型(Col-0)更为敏感的性状。同样条件下，离体叶片失水比野生型(Col-0)更低。植株干旱实验中，mpc1表现出更强的抗干旱能力。此证明AtMPC1参与气孔运动的调控，进而影响植物对干旱胁迫的响应，这有望在农作物品种改良以及作物产量或品质提升上提供帮助和支持，对农业生产具有重要意义。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C12N15/29
【公开号】CN105296505
【申请号】CN201510868130
【发明人】张伟, 沈建霖, 李春龙, 王美, 陈冬花, 马晓艳
【申请人】山东大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月1日