线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，特别设及一种用于动物线粒体基因组扩增的通用 引物混合物及其设计和扩增方法，W及包含所述通用引物混合物的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 线粒体是细胞内半自主性细胞器，来自于母系遗传并具有自身的一套基因组，其 基因稳定、排列保守几乎不发生重组，易于扩增和测序已成为研究动物进化的重要分子标 记，被广泛用于种群遗传结构、杂交、基因漂流生物及系统发育等方面的研究。
[0003] 大多数动物线粒体基因组的结构为闭合环状双链DNA(某些低等刺胞动物线粒体 基因组的结构为线性），包含了从分子序列到基因结构的全面信息，长度一般在14-20kb之 间。在进行动物线粒体基因组研究时，目前主要的测序策略，包括基于物理分离线粒体DNA 的克隆文库测序、基于传统PCR扩增产物直接测序的方法，W及新兴的高通量线粒体基因组 测序技术，后者又包括基于传统PCR预扩增线粒体DNA的高通量方法、鸟枪式高通量测序方 法W及从转录组数据中获得线粒体基因组序列的方法(Zardoya and Su紅ez 2007,沙森， 林立亮et al.2013,Cameron 2014)。
[0004] 然而，克隆文库测序方法成本高而速度慢，基于传统的PCR方法，则受限于引物通 用性与扩增效率的平衡，常需针对特定类群设计特异引物，或需根据已测出片段重新设计 引物扩增未知区域，大大拖慢了项目进展速度。鸟枪式高通量测序方法也存在着诸多问题， 如易混入基因组DNA来源的线粒体假基因，W及因读长片段短而含重复片段的控制区难W 拼接完整等。且所需测序通量大，生物信息拼接过程相对复杂。从转录组数据中获得线粒体 基因组序列的方法，成本较高且需结合传统PCR方法W获得完整线粒体基因组。而由于多数 无脊椎动物身体微小，测定线粒体基因组原则上只能采用一个个体的总DNA，物理、化学分 离方法(如差速离屯、，密度梯度离屯、、碱变性法)所得的富集线粒体DNA，其总量也不足W完 成高通量测序所需的建库工作。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明实施例公开了一种用于动物线粒体基因组扩增的通用 引物混合物及其设计和扩增方法，W及包含所述通用引物混合物的试剂盒。利用本发明的 提供引物混合物或试剂盒和提供的动物线粒体基因组扩增方法，结合新兴的高通量测序技 术，可W高效低成本地获得动物线粒体基因组信息。
[0006] 本发明提供一种用于扩增动物线粒体基因组的通用引物混合物，其包含具有W下 序列的通用引物或其化学修饰衍生物：
[0007] 沈Q ID NO.1:5 '-CCATTTCAYTGATGRTTYCC-3 '；
[0008] SEQ ID NO.2:5 '-GGTAAAAATCCTADAAAWGGNGG-3 '；
[0009] SEQ ID N0.3:5'-TGATTCTTTGGWCAYCCAGAAGT-3'；
[0010] 沈Q ID NO.4:5 '-GGTAATCAGARTATCGWCGNGG-3 '；
[0011] 沈Q ID NO.5:5 '-ACWATTGGWCAYCAATGATAYTG-3 '；
[0012] SEQ ID NO.6:5'-CCACARATTTCTGARCATTG-3'；
[0013] SEQ ID NO.7:5'-GTTGATCAAAG肥CWTGRCC-3'；
[0014] SEQ ID NO.8:5 '-TCWACAAARTGTCARTAYCA-3 '；
[0015] 沈Q ID NO.9:5 '-TTAAATCCTTWGARTAAAAYCC-3 '；
[0016] 沈Q ID NO.10:5 '-TTAGGTTGRGATGGNYTAGG-3 '；
[0017] 沈Q ID NO.11:5 '-CCHGAAGAACATAANCCRTG-3 '；
[0018] 沈Q ID NO.12:5 '-TGAGGATATCAACCNGARCG-3 '；
[0019] SEQ ID N0.13:5'-TAGAACAYRATGAAAYTTTGGWTC-3'；
[0020] SEQ ID NO.14:5 '-TTCTACTGGTCGWGCTCCAATYCA-3 '；
[0021] 沈Q ID NO.15:5 '-CCGGTYTGAACTCARATCATGTAA-3 '；
[0022] 沈Q ID NO.16:5，-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3，；
[0023] SEQ ID N0.17:5'-GTACAMCYACTRTGTTACGACTT-3'和
[0024] SEQ ID NO.18:5 '-GTGCCAGCADYYGCGGTTANAC-3 '，
[0025] 其中所述动物为除刺胞动物W外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，W及 蛙、蛇或鼠。
[0026] 在一个具体的实施方案中，所述通用引物3'端的两个碱基进行硫代修饰。
[0027] 在另一个具体的实施方案中，所述动物线粒体基因组可W来自W下动物:家衣鱼、 广斧瞳卿、勇斧瞳卿、丽拟丝鹏、樓桃蜂卿、马达加斯加蜂卿、金边地整、杜比亚蜂卿、中华真 地整、麻皮睹、细纹小家蚁、琵琶甲、挪屯、叶甲、竹虫、黄粉虫、洋虫、康瘦蚊、挪子织蛾、球鼠 妇、雷达蜗、毛蝴、泥蝴、青始、兰始、通俗腔蝴、菲牛赔、雨蛙、大泛树蛙、中国林蛙、乌梢蛇或 小鼠。
[0028] 本发明还提供了所述通用引物的设计方法，其特征在于，登录NCBI网站中的 GenBank 数据库捜索已测定的编号为 U37541.1、NC_002084.1、NC_002355.1、ΚΡ163643.1、 NC_003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_002651.1、NC_004371.1、NC_006895.1、NC_ 005437.1、 NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_ 002184.1、 NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、NC_023836.1和 NC_006665的部分无脊椎 动物线粒体基因组序列，进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将捜寻到的保守序列载 入引物设计软件，设计出所述用于动物线粒体基因组扩增的通用引物。
[0029] 本发明还提供一种利用所述的通用引物混合物进行动物线粒体基因组扩增的方 法，其特征在于，扩增体系包括样品体系和反应体系，
[0030] 其中每化1样品体系包含： 动物总 DNA 10-100 ng,
[003。引物貼介物 （0.0005-0.01) μηιο?XI8， 2 X退火缓冲液 2-3 μL，
[003^ 双蒸水 0.1-1μ1;
[0033] 每15μ1反应体系包含： Phi29 酶 lU-lOU， 焦憐酸酶 O.OlU-0 05U，
[0034] dNTP 0.005-0.01 μ 風〇1， 10Χ机i29缓冲液 1-5川 双蒸水 8-13姐
[00巧]扩增条件为： 变性 90-96仪，1-5分钟， 退火 缓慢冷却至室温，
[0036] 延伸 25-%打，12-18小时， 终止 65 °C, 5-15分钟。
[0037] 在一个具体的实施方案中，其中每化1样品体系包含： 动物总 DNA 10-100 ng, 引物混合物 0.005 μ molΧ 18，
[00；3 引 2X退火缓冲液 2.5 μ1, 双蒸水 0 5μΙ;
[0039] 每15μ1反应体系包含： Ρ1也9酶 5U， 焦憐酸酶 0.02 U，
[0040] dNTP 0.008 μιτιο?, 10XPhi29 缓冲被 2μ1, 双蒸水 11.2 μ1;:
[0041] 扩增条件为： 变性 90-96Χ：，1-5分钟， 退火 缓慢冷却至室温，
[0042] 延伸 25-35Γ，12-18 小时， 终[| 65 Cl 10分钟。
[0043] 在另一个具体的实施方案中，所述退火缓冲液是pH为7.6,化is-HCl终浓度为80mM MgCl2终浓度为20mM的混合溶液。
[0044] 本发明还提供了一种用于扩增动物线粒体基因组的试剂盒，其包含所述的通用引 物混合物，其中所述动物为除刺胞动物W外的具有环状线粒体基因组的无脊椎动物，W及 蛙、蛇或鼠。
[0045] 其中所述试剂盒还可W包括退火缓冲液、双蒸水、Phi29酶、焦憐酸酶、dNTP、化i29 缓冲液，及操作说明书。
[0046] 本发明提供的动物线粒体DNA通用引物混合物，结合PM29酶滚环扩增方法，可W 高效特异性地富集多种动物线粒体基因组，将线粒体DNA占总基因组DNA的质量比例从约 1%提升至80%左右，结合后续高通量测序方法可获得线粒体基因组完整序列。可有效排除 核基因组来源的假基因对拼接的