一种蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物及其反应体系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物及其反应体系。
【背景技术】
[0002]蜘蛛是一类捕食性的节肢动物，主要捕食昆虫，它们在害虫的生物防治、维护生态系统的平衡中起着非常重要的作用。注意保护天敌种库，促进天敌群落重建，能有效的控制诸多农业害虫，诸如飞虱、叶蝉、螟虫、棉蚜等的发生和危害。蜘蛛种类繁多，对其快速而准确的物种鉴定和开展区系分类研究极为重要，对蜘蛛种质资源的有效保护和充分利用方面具有重要的意义。
[0003]节肢动物线粒体基因组DNA是一种呈共价闭合环状，在细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传因子。与核DNA相比，线粒体基因组DNA具有母系遗传，拷贝数多，重组率低，进化速度较快等优点。已成为节肢动物的群体遗传学，系统发生学及保护生物学等研究领域的一个有利工具。它一般由13个蛋白质基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)共37个编码基因及一段非编码区(控制区)组成。其中控制区是线粒体基因组中进化速率最快的区域，其变异速率约为线粒体其他区域DNA的5到10倍，因而非常适合亲缘关系很近的群体间的比较研究，可作为相似种类及不同群体鉴定和多样性调查等研究方面的重要遗传标记。此外，线粒体控制区还存在不同程度的串联重复可变区，为研究控制区的进化机制和线粒体DNA复制转录调控机理提供了较好的研究材料。与同属于节肢动物的昆虫相比，对蜘蛛的线粒体全基因组的研究大幅落后。目前利用线粒体控制区序列进行蜘蛛遗传学和进化生物学研究大都是针对某一特定物种的特异引物，还没有一种能够有效的扩增大多数蜘蛛线粒体基因组控制区的通用引物。因此，设计扩增蜘蛛线粒体线粒体基因组控制区的通用引物，一方面为蜘蛛种类多样性调查分析提供有力工具，也为高效获得蜘蛛线粒体全基因组序列奠定基础。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物及其反应体系。
[0005]为实现本发明的目的，发明人提供以下技术方案:
蜘蛛线粒体基因组控制区的通用扩增引物是根据GenBank数据库中已经公布的蜘蛛线粒体全基因组序列设计的，正向引物Ctrl-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物Ctrl-R如SEQ ID NO:2 所示:
SEQ ID NO:1: 5' - AAGGGTGACGGGCGATAT-3';
SEQ ID NO:2: 5' - ATAGCTCTATTAGCTGACT-3'。
[0006]利用上述一对蜘蛛线粒体基因组控制区的通用扩增引物，PCR扩增测序后均可得到在浙江省农田采集的10种蜘蛛线粒体基因组控制区碱基序列。具体包括以下步骤: (I)采用DNA抽提试剂盒提取蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。
[0007](2)利用上述的一对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行PCR扩增和测序(结果见图1)。PCR反应体系为25μ 1，其中:2μ I模板DNA (约20ng)，2.5 μ I 10XPCRbuffer, 2 μ I 2.5mM MgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.3 μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积25 μ I ;PCR反应条件为:95° C预变性3分钟，94° C变性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸3分钟；35个循环后，72° C再延伸10分钟。
[0008](3) PCR扩增产物进行凝胶电泳，均得到1000-3500 bp的片段，经测序及比对GenBank中的同源序列，确定所扩增片段均为线粒体控制区序列。
[0009]作为优选，本发明所述的鉴定方法中，其中步骤(I)所述的蜘蛛种类包括但不限于下述:拟水狼蛛(Pira ta subpira ti cus)，三突花蛛(Ebrech tella tri cuspi data),横纹金蛛(Arg1pe bruennichi),维腹肖 Tetragnatha maxillosa),华 _ 肖蛾(Te tragna tha ni tens)，茶色新圆蛛(Neoscona theisi)、脉蜗蛛(Wadicosa vena trix)、黑色妮虎(Plexippus paykulli)，大腹园蛛(Araneus ven tricosus)、猫跳蛛(Carrho tusxanthogramma )。
[0010]本发明的优点是:
1.本发明提供的蜘蛛线粒体线粒体基因组控制区扩增引物，可以高效特异性的扩增多种蜘蛛的线粒体基因组控制区全序列，而不是仅仅扩增部分片段序列，能应用于蜘蛛不同分类阶元系统进化和分类研究；
2.本发明所述的通用引物及其设计方法可以作为通用引物PCR扩增原理及关键参数研究的具体实例，促进本发明所涉及领域的发展，因而具备重要的发明价值和理论意义；
【附图说明】
[0011]图1为本发明中蜘蛛线粒体基因组控制区扩增引物用以扩增不同种类蜘蛛线粒体ND4基因全序列的电泳图谱。其中，M: DNA分子量标准(Mark IV) ;1_10泳道依次为拟水狼蛛，三突花蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛾，华丽肖蛾，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛，猫跳蛛。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明实施例1:
(1)蜘蛛样品的采集，鉴定及保存
实施例中所用蜘蛛种类均用陷阱法采自浙江省余姚市农田。所采标本带回实验室进行信息登记，均用体视显微镜鉴定，以确定种类，用于分子生物学实验的蜘蛛标本用100%的酒精浸泡并保存于4° C冰箱备用。所采集的蜘蛛种类包括:拟水狼蛛，三花突蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛾，华丽肖蛾，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛、猫跳蛛；
(2)蜘蛛基因组总DNA的提取
采用DNA抽提试剂盒提取不同种类蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。DNA提取直接利用DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取。提取的总基因组-20° C保存备用；
(3)设计合成蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物
登陆NCBI网站中的GenBank数据库收索已公布的蜘蛛线粒体全基因组序列，经ClustalX软件同源比对,在控制区上下游找出保守的序列,利用Premier primer 5.0软件设计出蜘蛛线粒体基因组控制区扩增引物并送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。正向引物Ctrl-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物Ctrl-R如SEQ ID NO: 2所示:
SEQ ID NO:1: 5' - AAGGGTGACGGGCGATAT-3';
SEQ ID NO:2: 5' - ATAGCTCTATTAGCTGACT-3'；
(4)PCR扩增线粒体基因组控制区全序列及序列测定
利用上述的一对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行PCR扩增。其中，PCR反应体系为 25 μ 1，其中:2 μ I 模板 DNA (约 20ng)，2.5 μ I 10XPCR buffer, 2 μ I 2.5mMMgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.3 μ I 5U/μ I TaqDNA 聚合酶，加去离子水调至终体积25 μ I ；PCR反应条件为:95° C预变性3分钟，94° C变性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸3分钟；35个循环后，72° C再延伸10分钟。
[0013]PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测(结果见图1)，扩增片段用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)割胶回收。回收产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序结果同GenBank中已知的同源序列进行比对，确定其均为线粒体基因组控制区序列。
【主权项】
1.一种蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物，其特征是由两条单链寡聚核苷酸组成，其中正向引物Ctrl-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物Ctrl-R如SEQ ID NO: 2所示: SEQ ID NO:1: 5' - AAGGGTGACGGGCGATAT-3'; SEQ ID NO:2: 5' - ATAGCTCTATTAGCTGACT-3'。
2.如权利要求1所述的蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物，其特征在于所述的蜘蛛种类包括:拟水狼蛛，三突花蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛸，华丽肖蛸，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛，猫跳蛛。
3.根据权利要求1所述的的蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物，其特征在于引物的设计方法为:登陆NCBI网站中的GenBank数据库搜索已公布的蜘蛛线粒体全基因组序列，经ClustalX软件进行序列同源比对,找出保守的序列，再利用Premier primer 5.0软件设计出蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物。
4.一种采用权利要求1所述引物PCR扩增蜘蛛线粒体控制区的反应体系，其特征在于反应体系为 25μ 1，其中:2μ I 模板 DNA，2.5μ I 10XPCR buffer, 2 μ I 2.5 mM MgCl2,I μ I 10 mM (1见1^，各14 1 10 mM正、反向引物，(λ 3 μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积25 μ I ；PCR反应条件为:95° C预变性5分钟，94° C变性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸3分钟；35个循环后，72° C再延伸10分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种蜘蛛线粒体基因组控制区的扩增引物及其反应体系，扩增引物由两条单链寡聚核苷酸组成，其中正向引物Ctrl-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物Ctrl-R如SEQ ID NO:2所示。本发明的扩增引物可以快速、高效和特异地扩增多种蜘蛛的线粒体基因组控制区，对于蜘蛛种类的快速鉴定，种群多样性分析，种质资源保护利用等方面具有重要的意义，也为蜘蛛不同分类阶元系统进化的分析研究提供一种有力的工具。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104531846
【申请号】CN201410753795
【发明人】王正亮, 俞晓平, 李超
【申请人】中国计量学院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月11日