专利名称：日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法
技术领域：
本发明涉及一种线粒体基因组全序列扩增的方法，尤其涉及日本沼虾线粒体基 因组全序列扩增的方法，属于分子生物技术领域。
背景技术：
日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称青虾，隶属于甲壳纲，十足目，长
臂虾科，沼虾属。日本沼虾具有适应性强，分布广，食性杂，生长快，养殖经济效益高 等特点，是我国最重要的淡水经济虾类。目前对日本沼虾的研究工作多数集中于生长 特性、核型分析和育苗等方面，而有关使用分子生物学方法对日本沼虾的研究却相对较 少，主要集中于对核基因组遗传多样性方面的分析，因此，目前日本沼虾分子生物学方 面的信息量仍十分有限，开展更为广泛的分子水平上的研究极为重要。1981年，Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA)，进行了 全序列分析。线粒体(mitochondrion)是真核细胞内重要的细胞器，绝大多数动物线粒体 呈环状。由于它分子结构小、结构简单、进化速度快(线粒体基因的碱基替代率比单拷 贝的核基因组快5-10倍)等特点使得其成为动物起源进化及群体遗传分化的理想研究对 象。不同的生物线粒体基因组在结构、基因数量和基因排列方式等各方面均显示出极大 的多样性，因此线粒体基因组的全序列研究就成为了动物分子系统发生最有力的证据。目前，有研究建立了一种不需要提取线粒体基因组DNA而直接用线粒体进行聚 合酶链反应(PCR)的方法将得到的线粒体用高温加热，使线粒体膜破裂，释放DNA 后，直接用于PCR扩增。但此方法只适用于对线粒体基因组DNA纯度没有特别要求的 实验。而随着分子生物学技术的发展，分子生物学的实验技术也在日趋完善，实验要求 也在逐步提高。日本沼虾线粒体遗传多样性与动物分子系统发生的分析的基本要求是线 粒体基因组全序列的扩增，而线粒体基因组全序列的扩增首先要获得具有较高纯度和浓 度的日本沼虾线粒体DNA，目前提取线粒体DNA的方法有几种，如Triton法、碱变性 法、蛋白酶K法，但均存在缺点Triton法提取线粒体基因组DNA的产量低，而且容易 降解；碱变性法要求的实验条件比较严格，实验不容易重复而且提取的线粒体DNA可能 有环状和开环两种结构；蛋白酶K法所需的操作时间较长。本发明中采取高盐沉淀法进 行日本沼虾线粒体DNA的提取可以弥补以上方法提取线粒体DNA的不足。一般的PCR法难以扩增5kb以上的长链DNA模板，这严重限制了 PCR法的推广 和应用，通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer等，可以使长链DNA模板的扩增 成为可能。本发明使用了 LA Taq聚合酶，此酶在人的染色体上可以扩增长度可达17.5kb 的DNA片段，而以λ DNA为模板则可以扩增出高达35kb的片段，LA Taq聚合酶与一般 的Taq酶相比，具有校正功能和高保真的特点。
发明内容
本发明就是为了解决上述问题，克服如Triton法、碱变性法、蛋白酶K法，但均存在缺点Triton法提取线粒体基因组DNA的产量低，而且容易降解；碱变性法要求 的实验条件比较严格，实验不容易重复而且提取的线粒体DNA可能有环状和开环两种结 构；蛋白酶K法所需的操作时间较长等问题，提供一种日本沼虾线粒体基因组全序列扩 增的方法。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现一种日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，包括以下部分第一部分，高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组；第二部分，日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I (简称为，COI)和16S rRNA两个基因片段的扩增；第三部分，日本沼虾线粒体基因组DNA的长PCR扩增。第一部分中，所述高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组，包括以下步骤1)使用液氮将鲜活日本沼虾肌肉研磨至粉末状，取50mg转入一个1.5mL离心管 中加入溶液1500 μ 1，混勻，离心后弃上清；2)沉淀中加入溶液ΙΙ500μ1，混勻，离心后弃上清；3)沉淀加溶液IIlOO μ 1，混勻后加入20mg/mL蛋白酶Κ5μ1和10% SDS20yl，
快速混勻后进行消化；4)加入50 μ 1饱和醋酸钠，混勻，离心后取上清于Eppendrof管中；5)重复步骤4) 一次；6)上清中加入等体积的酚氯仿异醇的比例为25 24 1，振荡，离心后取 上层水相重复该过程抽提一次，取上层水相；7)加入2倍体积冰乙醇或等体积异丙醇，冰浴，离心后弃上清；8)用70%冰乙醇漂洗沉淀，离心后彻底去上清；9)沉淀于空气中自然部分干燥，加入50-100 μ IRTE液溶解，贮于4°C。进一步，所述溶液I 为 Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 10mmol/L, MgC12 5mmol/ LpH 7.5。进一步，所述溶液II 为 Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 400mmol/L, EDTA 2mmol/ LpH 8.0。第二部分中，所述日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16S rRNA两个基因片段的扩增，包括以下几步骤l)COI和16S rRNA两个基因片段引物的选择用于扩增日本沼虾线粒体基因片 段的是CO I通用引物以及16S rRNA的通用引物；2)两个基因片段扩增的PCR反应反应的模板为权利要求1高盐沉淀法所提取 的日本沼虾线粒体基因组DNA，为lOOng，反应总体系为50μ1，其中10 XLA PCR Buffer 115 μ 1，dNTPs 2μ L 各 2.5mmol/L，引物各 1 μ 1、20ymol/L, LA Taq 酶 0.5 μ 1、2U ；PCR反应条件为94°C预变性4min; 94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸 Imin, 30个循环，最后72°C延伸lOmin。第三部分中，所述日本沼虾线粒体基因组DNA的长PCR扩增，包括以下步 骤1)用于日本沼虾线粒体基因组DNA长PCR扩增的引物设计以扩增得到的COI基因片段和16SrRNA片段的序列为模板在两端分别设计引物，用于扩增日本沼虾线粒体 基因组DNA环的其他部分；以COI基因片段为起点、16SrRNA基因片段为终点的半环区域设计的引物对为 SrCO 2F 和 SrCO 2R ；以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的半环区域设计的引物对为 COSr 2F 和 COSr 2R ；2)根据设计的长PCR引物序列扩增日本沼虾线粒体基因组DNA的两个半环 使用TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶；反应条件如下94°C预变性lmin，98°C变性lOsec，56.5°C退火30sce，68°C延 伸15min ；经35个循环后再在72°C延伸15min ；产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰的条带；测序，将得到的序列拼接后，即可得到日本沼虾线粒体基因组全序列。本发明的有益效果1、本发明所采取的高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组，它具有线粒体基因 组DNA提取的浓度大，纯度高，产物不易降解、实验条件要求不严格、实验具有可重复 性、操作时间相对较短等优点。2本发明的长PCR引物设计方面也采取了具有代表性且容易获得通用引物的16Sr RNA和COI基因片段作为引物设计的选择区域，这样就可以保证扩增日本沼虾线粒体基 因组全序列的可重复性，以便后续不同要求的实验的进行。3、测序，将测得序列在Genbank上同源序列比对，确定是此两个基因，然后再 从Genbank中查询多个16Sr RNA和COI基因片段进行比对，找到两个基因片段的保守区 域，在保守区域内设计引物，目的是保证对日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的可重复 性，然后用这样设计的引物即可以进行长PCR的扩增，得到日本沼虾线粒体基因组全序 列。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。
图1为日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16SrRNA两个基
因片段的扩增。图2为以COI基因片段为起点、16S rRNA基因片段为终点的半环区域设计的引 物所扩增的片段。图3为以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的半环区域设计的引 物所扩增的片段。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例试验1.高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组
使用液氮将采集于中国上海的鲜活日本沼虾(Macrobrachium nipponense)肌肉 研磨至粉末状，取50mg转入一个1.5mL离心管中加入溶液I (Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 10mmol/L, MgCl25mmol/L pH 7.5) 500 μ 1,混勻，2000r/min，IOmin,弃上清。沉淀中 加入溶液 II (Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 400mmol/L, EDTA 2mmol/L pH 8.0) 500 μ 1,混 勻，3500r/min，IOmin,弃上清。沉淀加溶液IIlOO μ 1，混勻后加入20mg/mL蛋白酶K 5 μ 1和10% SDS 20 μ 1，快速混勻。55°C水浴1.5h。加入50 μ 1饱和醋酸钠，混勻，轻 摇 15S。15000r/min, 4°C,离心 15min，取上清于 Eppendrof 管中。再一次加入 50 μ 1 饱和醋酸钠，混勻，轻摇15S。15000r/min, 4°C,离心15min，取上清于Eppendrof管 中。上清中加入等体积酚氯仿异醇(25 24 1)，温和振荡8min，10000r/min,
4离心lOmin，取上层水相重复该过程抽提一次，轻取上层水相。加入2倍体积冰乙 醇或等体积异丙醇，冰浴30min后，15000r/min，4°C,离心lOmin，弃上清。用70%冰 乙醇漂洗沉淀，15000r/min，离心2min，彻底去上清。沉淀于空气中自然部分干燥，加 入适量RTE液溶解，贮于4°C。试验2.日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16SrRNA两个基
因片段的扩增CO I和16S rRNA两个基因片段引物的选择用于扩增日本沼虾线粒体基因片 段的是CO I通用引物(引物序列为F 5，GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3，和 R 5，TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3，)，以及 16S rRNA 的通用引物(F 5，CGCCTGTTTAACAAAAACAT 3'禾口 R 5，CCGGTTGAACTCAGATCA 3，)。两个基因片段扩增的PCR反应反应的模板为权利要求1所提取的日本沼虾线 粒体基因组DNA，约为100ng，反应总体系为50 μ 1，其中IOXEx TaqBuffer5 μ 1，dNTPs 2口1(各2.511111101/0，引物各 1 μ 1 (20 μ mol/L)，LA Taq酶0.5 μ 1 (2U) .PCR反应条件为 94°C预变性4min; 94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C 延伸lOmin。每次反应设立不含DNA模板的空白对照，扩增产物经的琼脂糖凝胶电泳检 测。图1日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16SrRNA两个基因片 段的扩增。左起第一泳道为D15000标准分子量；第二、三泳道为cytochrome oxidase I(COI)基因片段；第四、五泳道为16S rRNA基因片段。试验3.日本沼虾线粒体基因组全序列的长PCR扩增用于日本沼虾线粒体基因组DNA长PCR扩增的引物设计以扩增得到的COI 基因片段和16S rRNA片段的序列为模板在两端分别设计引物，用于扩增日本沼虾线粒体 基因组DNA环的其他部分。以COI基因片段为起点、16S rRNA基因片段为终点的半环 区域设计的引物为 SrCO 2F (5，ATTGAAGGCTTGAATGAAAGGTTG 3')禾口 SrCO 2R( 5’ TAGAAAGAGGAGTAGGCACAGGAT3‘)；以 16S rRNA 基因片段为起点、COI 基因 片段为终点的半环区域设计的引物为COSr 2F(5，CCTGTGCCTACTCCTCTTTCTA 3，) 和 COSr 2R (5，CTACTGACTATGCT-ACCTTCGC 3，)。根据设计的长PCR引物序列扩增日本沼虾线粒体基因组DNA的两个半环使用 TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶，反应条件如下94°C预变性Imin，98°C变性lOsec，56.5°C退火30sce，68°C延伸15min。经35个循环后再在72°C延伸15min。产物经 琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰的条带。图2以COI基因片段为起点、16SrRNA基因片段为终点的半环区域设计的引物 所扩增的片段。左起第一泳道为D15000标准分子量；第二、三泳道为扩增片段。图3以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的半环区域设计的引物 所扩增的片段。右起第一泳道为XDNA/Hindlll标准分子量；第二、三泳道为扩增片段。测序，将得到的序列拼接后即可得到日本沼虾线粒体基因组全序列。本发明所采取的高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组是扩增日本沼虾线粒体 基因组全序列的基础，它具有线粒体基因组DNA提取的浓度大，纯度高，产物不易降 解、实验条件要求不严格、实验具有可重复性、操作时间相对较短等优点。本发明提取的日本沼虾线粒体基因组的完整性对于长PCR扩增日本沼虾线粒体 基因组全序列至关重要，因此，在提取过程中，每步摇勻的动作不易过猛、水浴时间不 易过长。饱和醋酸钠的作用是使大部分线性大分子量的DNA和蛋白质在SDS作用下变 性形成沉淀，而环状线粒体DNA仍为自然状态，通过高速离心，便可除去绝大部分细胞 碎片、核DNA及蛋白质，而线粒体DNA仍留在上清中，因此，饱和醋酸钠可以多使用 一次，以提高所提取的日本沼虾线粒体的纯度。本发明的长PCR引物设计方面也采取了具有代表性且容易获得通用引物的16Sr RNA和COI基因片段作为引物设计的选择区域，这样就可以保证扩增日本沼虾线粒体基 因组全序列的可重复性，以便后续不同要求的实验的进行，日本沼虾的16Sr RNA和COI 两个基因位于线粒体基因组，采用甲壳类16& RNA和COI基因扩增的通用引物扩增出两 个基因片段，测序，将测得序列在Genbank上同源序列比对，确定是此两个基因，然后 再从Genbank中查询多个16Sr RNA和COI基因片段进行比对，找到两个基因片段的保守 区域，在保守区域内设计引物，目的是保证对日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的可重 复性，然后用这样设计的引物即可以进行长PCR的扩增，得到日本沼虾线粒体基因组全 序列。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说 明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要 求书及其等同物界定。
权利要求
1.一种日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，包括以下部分第一部分，高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组；第二部分，日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I和16S rRNA两个基因片段的扩增；第三部分，日本沼虾线粒体基因组DNA的长PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，其特征在于，第 一部分中，所述高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组，包括以下步骤1)使用液氮将鲜活日本沼虾肌肉研磨至粉末状，取50mg转入一个1.5mL离心管中加 入溶液1500 μ 1，混勻，离心后弃上清；2)沉淀中加入溶液ΙΙ500μ1，混勻，离心后弃上清；3)沉淀加溶液IIlOOμ 1，混勻后加入20mg/mL蛋白酶K 5 μ 1和10% SDS20 μ 1，快 速混勻后进行消化；4)加入50μ 1饱和醋酸钠，混勻，离心后取上清于Eppendrof管中；5)重复步骤4)一次；6)上清中加入等体积的酚氯仿异醇的比例为25 24 1，振荡，离心后取上层 水相重复该过程抽提一次，取上层水相；7)加入2倍体积冰乙醇或等体积异丙醇，冰浴，离心后弃上清；8)用70%冰乙醇漂洗沉淀，离心后彻底去上清；9)沉淀于空气中自然部分干燥，加入50-100μ IRTE液溶解，贮于4°C。
3.根据权利要求2所述的日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，其特征在于，所 述溶液 I 为 Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 10mmol/L, MgCl25mmol/LpH 7.5。
4.根据权利要求2所述的日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，其特征在于，所 述溶液 II 为 Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 400mmol/L, EDTA 2mmol/LpH 8.0。
5.根据权利要求1所述的日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，其特征在于，第 二部分中，所述日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16S rRNA两个基 因片段的扩增，包括以下几步骤1)COI和16SrRNA两个基因片段引物的选择用于扩增日本沼虾线粒体基因片段的 是CO I通用引物以及16S rRNA的通用引物；2)两个基因片段扩增的PCR反应反应的模板为权利要求1高盐沉淀法所提取的 日本沼虾线粒体基因组DNA，为IOOng，反应总体系为50 μ 1，其中10XLA PCR Buffer 115 μ 1，dNTPs 2μ L 各 2.5mmol/L，引物各 1 μ 1、20ymol/L, LA Taq 酶 0.5 μ 1、2U ；PCR反应条件为94°C预变性4min; 94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸lmin， 30个循环，最后72°C延伸lOmin。
6.根据权利要求1所述的日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，其特征在于，第 三部分中，所述日本沼虾线粒体基因组DNA的长PCR扩增，包括以下步骤1)用于日本沼虾线粒体基因组DNA长PCR扩增的引物设计以扩增得到的COI基 因片段和16S rRNA片段的序列为模板在两端分别设计引物，用于扩增日本沼虾线粒体基 因组DNA环的其他部分；以COI基因片段为起点、16S rRNA基因片段为终点的半环区域设计的引物对为SrCO2F 和 SrCO 2R ；以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的半环区域设计的引物对为COSr 2F 禾口 COSr 2R ；2)根据设计的长PCR引物序列扩增日本沼虾线粒体基因组DNA的两个半环使用 TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶；反应条件如下94°C预变性lmin，98°C变性lOsec，56.5°C退火30sce，68°C延伸 15min ；经35个循环后再在72°C延伸15min ；产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰的条带；测序，将得到的序列拼接后，即可得到日本沼虾线粒体基因组全序列。
全文摘要
本发明公开了一种日本沼虾线粒体基因组全序列扩增的方法，包括高盐沉淀法提取日本沼虾线粒体基因组；日本沼虾线粒体基因中的cytochrome oxidase I(CO I)和16S rRNA两个基因片段的扩增；日本沼虾线粒体基因组DNA的长PCR扩增。在分子遗传进化研究中，线粒体DNA(mtDNA)是十分有用的材料。由于线粒体基因在细胞减数分裂期间不发生重排，而且点突变率高，所以有利于检查出在较短时期内基因发生的变化，有利于比较不同物种的相同基因之间的差别，确定这些物种在进化上的亲缘关系。
文档编号C12N15/10GK102010860SQ20101052915
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者冯建彬, 姜虎成, 李家乐, 马克异 申请人:上海海洋大学