专利名称：玉米褪绿斑驳病毒检测用引物及探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及玉米褪绿斑驳病毒检测用弓I物及探针。
背景技术：
玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV)属于番茄丛矮病毒 科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，是危害玉米的重要病毒，另外 还可侵染小麦、大麦、燕麦、高粱和一些杂草。寄主被侵染后，症状表现为坏死斑驳、卷曲、 叶尖坏死、矮化、植株死亡等。自然侵染作物导致损失10% 15%，试验玉米损失达59% ； 与玉米褪绿矮缩病毒(Maizechlorotic dwarf virus, MCDV)或小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus, WSMV)共同侵染损失高达91%。该病毒已列入我国进境植物检疫性 有害生物名录之中。国内学者对该病毒研究不是很多，因而相关资料及防治经验很少。目前该病毒分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国(堪萨斯州、内布拉斯加州、夏威 夷)及泰国。MCMV可经玉米种子、介体甲虫、蓟马等传毒，一旦田间有植株发病，病毒将快速 扩散，往往在短时间内就会导致玉米大面积发病，导致严重的经济损失。根据风险分析的介 体适生区，一旦该病毒病发生，导致我国的玉米经济损失将高达140亿元人民币。2009年， 山东出入境检验检疫局首次在美国进境大豆混杂的玉米种子中截获该病毒，说明该病毒传 入的风险很高。本发明选择玉米褪绿斑驳病毒P32蛋白基因保守区序列，设计用于实时荧光 RT-PCR检测的引物及探针，通过对反应的退火温度的优化建立了玉米褪绿斑驳病毒的实时 荧光RT-PCR检测方法，反应结束后即可根据扩增曲线判定样品中是否含有玉米褪绿斑驳病毒。
发明内容
本发明目的在于提供用于玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测的引物及探针 序列。本发明通过分析已报道的玉米褪绿斑驳病毒p32蛋白基因的保守区序列，设计 引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表MCMVf& MCMVr所示；所述探针的核苷酸序列如序列表MCMVp所示，该探针一端标记有报告荧光染 料，另一端标记有淬灭荧光染料。可用的报告荧光染料有FAM\heX\tet\j0e\ViC\fitC\Cy3\ cy5，可用的淬灭荧光染料有 TAMRA\rox\dabcy 1 \bhql \bhq2。根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核 苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5'端，淬灭荧光染料标记在探针的3'端， 两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距 离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目 的扩增片段杂交，由于Taq DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段 将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对玉米褪绿斑驳病毒的检测。本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的实时荧光RT-PCR检测方法，其以 样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩 增曲线判定结果。具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在50 μ L 反应体系中加入20. 25μ L DEPC处理水，25yL 2X无UNG酶的主混合液(Master Mix without UNG)，1· 25 μ L40X 反转录酶及 RNA 酶抑制剂混合液(MultiScribe and RNase Inhibitor Mix)，1 μ L 引物 MCMVf (20 μ mol/L)，1 μ L 引物 MCMVr (20 μ mol/L)，0· 5 μ L 探针 MCMVpQOymol/L)，aigSRNA。一步法反转录荧光 PCR 主混合液(PCR TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents) _ 自 Applied Biosystems &目。其中，上述反应条件可以是:42°C,5min；95°C，10s ；95°C，5s，60°C，20s，共 40 个循环。当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针， 以适用于不同方法的实时荧光RT-PCR检测。进一步，还可以将本发明引物、探针及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明根据玉米褪绿斑驳病毒P32蛋白基因保守区序列设计引物及探针，该引物 特异性好，用于实时荧光RT-PCR检测灵敏度高。本发明检测方法具有特异性好和灵敏度高 的特点，其能够快速准确地判断样品是否有玉米褪绿斑驳病毒，为进出口安全提供了保证。
图1是实时荧光RT-PCR技术检测玉米褪绿斑驳病毒的结果；图2是本发明检测方法的灵敏度实验。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1引物及探针设计根据MCMV P32蛋白基因(GenBank No. NC_003627)的公开序列，采用探针设计软 件Express2.0设计引物及引物，引物序列为MCMVf (正向)5' -ACG GTA CGT TCG GCTAGC A-3'MCMVr(反向)5' -CGG GCGAGGACA CAT GA-3'所述探针的序列为MCMVp :5' -TTC GCT TCT CCC TGC TGGCCG-3'，该探针的 5' 端用报告荧光染料FAM标记，3 ‘端用淬灭荧光染料TAMRA标记。实施例2总RNA的提取1)取0. Ig发病叶片，液氮研成粉末，移入灭菌的1.5mL离心管中，然后加入ImL的 Trizol试剂，剧烈震荡摇勻；2)4°C,12000g离心IOmin以除去不溶的成份，将上清液转入一新的1. 5mL离心管 中；3)室温下保持5min，加0. 2mL氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持2-15min后， 4°C，12000g 离心 15min ；
4)将上层水相转移到新的1. 5mL离心管中，加0. 5mL异丙醇，颠倒混勻，室温下保 持 15min ；5) 40C，12000g离心lOmin，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；6)倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4°C，7500g离心5min (如沉淀悬 浮起来，则用12000g)，弃去乙醇；7)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40 μ L dH20(DEPC处理)中，_20°C保存备用。实施例3实时荧光RT-PCR扩增方法的建立
1、实时荧光RT-PCR反应体系以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应。在50 μ L反应体系中加入20. 25 μ L DEPC处理水，25 μ L 2 X无UNG酶的主混合液 (Master Mix without UNG)，1· 25 μ L40X 反转录酶及 RNA 酶抑制剂混合液(MultiScribe and RNase Inhibitor Mix)，1 μ L 弓|物 MCMVf(20 μ mol/L)，1 μ L 弓|物 MCMVr (20 μ mol/L)， 0. 5 μ L探针MCMVp (20 μ mol/L)，2ng总RNA。一步法反转录荧光PCR主混合液(PCR TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents) _ 自 Applied Biosystems &目。2、实时荧光RT-PCR反应条件将样品管放入Corbett Research公司Rotor Gene 3000荧光PCR仪后，设置如下 条件进行条件:42°C,5min ；95°C，10s ；95°C，5s，60°C，20s，共 40 个循环。每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。实施例4 MCMV实时荧光RT-PCR方法的特异性确定以表现症状的玉米叶片总RNA为模板，以健康叶片作为对照，通过实时荧光 RT-PCR检测荧光强度变化。试验结果以表现症状的玉米叶片总RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的 荧光强度变化，而健康对照的荧光强度没有变化，结果见图1。实施例5 MCMV实时荧光RT-PCR方法的灵敏度实验用DEPC水倍比稀释总RNA，进行相对灵敏度检测。在50 μ L反应体系中，总RNA分 别为300ng、30ng、3ng、0. 3ng、30pg、3pg、0. 3pg。检测结果如图2所示，最低检测限是3pg。
权利要求
1.一种玉米褪绿斑驳病毒检测用引物，其核苷酸序列为 MCMVf 5' -ACG GTA CGT TCG GCT AGC A-3'MCMVr 5' -CGG GCG AGG ACA CAT GA-3'。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为MCMVp 5' -TTC GCT TCT CCC TGC TGG CCG-3'，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。
3.如权利2要求所述的探针，其特征在于，该探针5'端标记有FAM荧光染料，3'端标 记有TAMRA荧光染料。
4.一种检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用权利要求1所 述的引物以及权利要求2或3所述的探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数 据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，实时荧光RT-PCR的反应过程中的退火温度 为 60 0C ο
6.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其还包括权利要求2或3所述的探针。
全文摘要
本发明提供了一种玉米褪绿斑驳病毒检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表MCMVf& MCMVr所示，所述探针的核苷酸序列如序列表MCMVp所示。本发明还进一步提供了检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明引物及探针特异性好，检测方法快速简单，准确性好，灵敏度高，为可能携带玉米褪绿斑驳病毒植物材料的进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/70GK102102134SQ20101052881
公开日2011年6月22日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者张永江, 朱水芳, 李明福, 李桂芬, 相宁, 赵文军, 魏梅生 申请人:中国检验检疫科学研究院