分子信标探针及引物对、GC基因SNPs位点检测方法与流程

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种分子信标探针及引物对、gc基因snps位点检测方法。

背景技术：

维生素d结合蛋白(group-specificcomponent/vitamindbindingprotein，gc)最初被称为“种群特异性成分(沿用gc作为其正式缩写的原因)”，是白蛋白超家族的一员，存在于血浆等多种体液和多种类型的细胞表面。在血浆中，gc能够与大部分维生素d或其代谢产物结合，并将其运输到靶组织；同时，gc还具有其它功能，如清除胞外肌动蛋白、转运脂肪酸、结合内毒素、保护并增强补体因子c5a功能、影响t细胞反应、调节巨噬细胞和破骨细胞，从而在脂代谢、免疫反应、骨健康等方面发挥特定作用。

编码gc蛋白的基因在人染色体上定位为4q13.3，具有超过200多种单核苷酸多态性位点和相应基因型，其中三种最主要的基因型是根据位于第11号外显子上的rs7041和rs4588两个snps判定的。已知rs7041的g/t多态性和rs4588的a/c(最新数据显示有极其罕见的t)多态性在单倍体中的基因型为g-c、t-c和t-a三种(没有g-a)，文献习惯上分别用1s、1f和2表示这三种单倍体基因型[对应第432与436(原第416与420)位的氨基酸分别是glu与thr、asp与thr和asp与lys]，并可组合成6种二倍体基因型，即1f/1f、1s/1s、2/2、1f/1s、1f/2和1s/2。这些snps所致的氨基酸差异会导致血浆gc浓度差异，并可能对gc蛋白的功能产生不同程度的影响而使人体可能表现出差异的表型或健康效应。gc浓度差异也可能通过影响血循环25羟维生素d(25-hydroxyvitamind，25ohd)浓度水平而产生维生素d营养水平差异相关的表型。已知有9.9％的血循环25ohd浓度水平差异与上述rs7041和rs4588这两个snps有关。因此，对人群的这两个snps进行检测，对分析gc基因与多种疾病风险和表型的相关性具有研究与预测价值。

针对rs7041和rs4588两个snps的基因型分析，最早用多种检测技术同时进行验证分析的论文发表于1992年。该研究旨在分析鉴定这两个snps在人群中实际存在的情况，采用的方法包括：聚合酶链式反应后的限制性酶切片段长度多态性分析(pcr-rflp)、taqman探针和测序三种。后来研究采用的方法还包括：等位基因特异性竞争pcr基因分型法、芯片法等。pcr-rflp虽然廉价，但其操作步骤繁琐，且需要两个独立的rflp实验进行基因分型，在分析大量样本时，尤其费时。taqman探针、kasp和goldengate等技术也不能在一次反应中同时对两个多态性位点进行分析。以taqman探针不论混合还是单独反应分析这两个相距10bp的rs7041和rs4588时，都需精心设计、测试多套探针，增加了试剂成本。kasp、goldengate、时间飞行质谱、测序等方法都依赖于昂贵的设备、封闭的试剂和较高的实验操作技术，甚至需要摸索建立适宜的检测条件；且因其单次运行所需试剂用量有最低要求，间歇与随时开机运行的成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种分子信标探针及引物对、gc基因snps位点检测方法，旨在解决现有gc基因snps位点检测步骤繁琐、耗时、成本高的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种用于检测gc基因snps位点的分子信标探针，所述分子信标探针用于同时检测gc基因多态性位点rs7041和rs4588，包括依次连接的上游序列、核心序列和下游序列，其中，所述核心序列为：5’-[g/t]gccacaccca[a/c]-3’或5’-[g/t]tgggtgtggc[a/c]-3’，所述上游序列和所述下游序列均包括：至少三个与gc基因互补配对的碱基或至少两个与gc基因互补配对的c或g碱基；

同时，所述分子信标探针的长度为25-35bp，tm值为62-65℃，所述分子信标探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团标记。

另一方面，本发明提供一组用于检测gc基因snps位点的分子信标探针和引物对，所述分子信标探针为上述分子信标探针，且所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物和所述第二引物的长度均为20-30bp；且所述第一引物包含5’-ggcagagcg-3’，所述第二引物包含5’-ggaggc-3’或5’-gaggt-3’。

再一方面，本发明提供一种用于检测gc基因snps位点的试剂盒，包括上述分子信标探针和引物对，还包括taqhs酶、dntps、pcr缓冲液。

最后，本发明提供一种gc基因snps位点的检测方法，包括如下步骤：

提取dna样本；

将所述dna样本与上述试剂盒配成pcr反应体系，进行pcr扩增；

根据所述扩增结果分析样本中gc基因snps位点。

本发明提供的分子信标探针，其核苷酸序列可覆盖gc基因的rs7041和rs4588两个snps位点，仅需要qpcr仪和一条荧光标记的分子信标探针，即可实现对大量样品的gc基因中两个重要多态性位点的分析，加上qpcr仪运行成本和操作技术要求相对较低，这就大大降低了检测成本和分析难度。

同时，设计一组与该分子信标探针配套的引物对，一条(第一引物)位于rs7041上游100bp范围内的特异性引物，另一条(第二引物)位于rs4588下游100bp范围内的特异性引物。rs7041上游100bp的适宜引物都有共同位置上9bp的片段5’-ggcagagcg-3’；rs4588下游100bp的适宜引物有两群，一群具有6bp的共同位置片段5’-ggaggc-3’，另一群具有5bp的共同位置片段5’-gaggt-3’；这样可实现对大量样品的gc基因中两个重要多态性位点的分析。

该用于检测gc基因snps位点的试剂盒，因含有本发明特有的分子信标探针和引物对，所以具有高效、灵敏、特异性强的特点，而且该试剂盒成本低、使用方便，仅需要qpcr仪可实现对大量样品的gc基因中两个重要多态性位点的分析。

该gc基因snps位点的检测方法，因使用本发明特有的试剂盒，根据荧光信号在熔解曲线程序中出现的峰型判断gc不同的基因型。因此具有检测步骤简单、耗时少、成本低的特点。

附图说明

图1为本发明实施例2中同时检测由rs7041和rs4588组成的6种基因型原始数据图；

图2为本发明实施例2中同时检测由rs7041和rs4588组成的6种基因型原始数据处理图；

图3为本发明实施例2中rs7041和rs4588组成的6种基因型的pcr检测产物测序结果图；

图4为本发明实施例2中同时检测由rs7041和rs4588组成的6种基因型的大量样本原始数据图；

其中，附图标记为：

1：gc-1s/1s；2：gc-1f/1f；3：gc-2/2；

4：gc-1s/1f；5：gc-1s/2；6：gc-1f/2。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种用于检测gc基因snps位点的分子信标探针，其用于同时检测gc基因多态性位点rs7041和rs4588，包括依次连接的上游序列、核心序列和下游序列，其中，核心序列为：5’-[g/t]gccacaccca[a/c]-3’或5’-[g/t]tgggtgtggc[a/c]-3’，上游序列和下游序列均包括：至少三个与gc基因互补配对的碱基或至少两个与gc基因互补配对的c或g碱基；同时，分子信标探针的长度为25-35bp，tm值为62-65℃，分子信标探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团标记。

该分子信标探针的核苷酸序列覆盖gc基因的rs7041和rs4588两个snps位点，仅需要qpcr仪和一条荧光标记的分子信标探针，即可实现对大量样品的gc基因中两个重要多态性位点的分析，加上qpcr仪运行成本和操作技术要求相对较低，这就大大降低了检测成本和分析难度。

具体地，该分子信标探针的长度为25-35bp。分子信标探针是一种可形成发夹结构的寡核苷酸探针，本发明实施例中，“环”一般长15-30个核苷酸，是与目标序列互补的探针主体，tm值比qpcr的退火温度高7-10℃，如推荐ta＝55℃，探针的tm便在62-65℃；“茎”一般长5-7对核苷酸，可部分或全部由人为加入的碱基形成，cg碱基含量占75-100％，以使“茎”的tm比qpcr的ta高7-10℃，荧光分子一端不宜紧接g碱基，避免后者的荧光淬灭作用。

该分子信标探针核心序列包含一段两个snps(rs7041和rs4588)之间的dna片段(10bp)，再通过人工设计上有序列和下游序列，形成茎环结构。具体地，在本发明一优选实施例中，分子信标探针的核苷酸序列为：

seqidno:1：cacagctgatgccacacccaaggaactgtg；或

seqidno:2：cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg；或

seqidno:3：ctggtctgatgccacacccaaggaaccga。

具体地，分子信标探针的5’端标记的荧光报告基团为fam、hex、tet、vic、rox、cy5、cy3、joe、alex和cal中的至少一种；分子信标探针的3’端标记的荧光淬灭基团为dabcyl、bhq、eclipse和tamra中的至少一种。

另一方面，本发明实施例提供了一组用于检测gc基因snps位点的分子信标探针和引物对，该分子信标探针为上述分子信标探针，且该引物对包括第一引物和第二引物，第一引物和第二引物的长度均为20-30bp；且第一引物包含5’-ggcagagcg-3’，第二引物包含5’-ggaggc-3’或5’-gaggt-3’。

具体地，在本发明一优选实施例中，第一引物与分子信标探针在同一链上，且第一引物的tm值为62-65℃，第二引物的tm值为58-60℃。一优选实施例中，第一引物为：seqidno:4：ggtttttcagactggcagagcgacta；

第二引物为：seqidno:5：gaggtgagtttatggaacagca。

又一方面，本发明实施例提供一种用于检测gc基因snps位点的试剂盒，包括本发明实施例的分子信标探针和引物对，还包括taqhs酶、dntps、pcr缓冲液。该用于检测gc基因snps位点的试剂盒，因含有本发明特有的分子信标探针和引物对，所以具有高效、灵敏、特异性强的特点，而且该试剂盒成本低、使用方便，仅需要qpcr仪可实现对大量样品的gc基因中两个重要多态性位点的分析。

最后，本发明实施例提供一种gc基因snps位点的检测方法，包括如下步骤：

提取dna样本；

将上述dna样本与本发明实施例的试剂盒配成pcr反应体系，进行pcr扩增；

根据扩增结果分析样本中gc基因snps位点。

该gc基因snps位点的检测方法，因使用本发明实施例特有的试剂盒，根据荧光信号在熔解曲线程序中出现的峰型判断gc不同的基因型，因此检测步骤简单、耗时少、成本低的特点。

具体地，上述pcr扩增为降落pcr扩增。

具体地，上述dna样本为人全血dna样本。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。本说明书中的英文缩写的全称和中文内容对应如下：

1)25ohd：25羟维生素d，25-hydroxyvitamind

2)asp：天冬氨酸，asparticacid

3)dab：二甲氨基偶氮苯甲酰(一种荧光淬灭剂)，dabsyl

4)fam：羧基荧光素，carboxyfluorescein

5)gc：种群特异性成分/维生素d结合蛋白，group-specificcomponent/vitamindbindingprotein。斜体表示其基因。

6)glu：谷氨酸，glutamicacid

7)kasp：等位基因特异性竞争pcr基因分型法，kbiosciencescompetitiveallele‐specificpcrgenotypingsystem

8)lys：赖氨酸，lysine

9)ncbi：美国国立生物技术信息中心，nationalcenterforbiotechnologyinformation

10)pcr：聚合酶链式反应，polymerasechainreaction

11)qpcr：定量pcr，quantitativepolymerasechainreaction

12)rflp：限制性酶切片段长度多态性，restrictionfragmentlengthpolymorphism

13)snp(s)：单核苷酸多态性位点，singlenucleotidepolymorphism(s)

14)thr：苏氨酸，threonine

15)ta：退火温度，annealingtemperature

16)tm：熔解温度，meltingtemperature。

实施例1分子信标探针及引物对设计

1)获得目标snps基本信息

从美国国立生物技术信息中心(ncbi)网站的snp数据库查询gc基因的rs7041和rs4588这两个snps位点信息，结果如下：

rs7041[homosapiens]：agcgactaaaagcaaaattgcctga[g/t]gccacacccacggaactggcaaagc

rs4588[homosapiens]：gcaaaattgcctgatgccacaccca[a/c/t]ggaactggcaaagctggttaacaag

然后在geneview链接的dbsnp数据库中核查这两个snps。rs7041确认为[g/t]二态性，rs4588确认为[a/c]二态性，与文献报道一致。rs4588的t碱基可能极其罕见，根据后续设计的探针，t将被合并计入a或c的情况。然后再在ncbi的gene数据库查询人类gc基因信息(geneid：2638)，并链接至dna序列(refseqgene：ng_012837.2)。通过序列比对，将以上两个snps定位到dna，确定一段这两个snps居中的dna片段(如下所示)，用于后续的引物和探针设计，两个snps间隔10bp，使一条探针覆盖这两个snps成为可能。

2)探针与引物设计

分子信标探针和引物的设计总结为以下法则：

①“环”一般长15-30个核苷酸，是与目标序列互补的探针主体，tm值比qpcr的退火温度(ta)高7-10℃，如推荐ta＝55℃，探针的tm便在62-65℃；

②探针的两端到临近snp的核苷酸序列中应至少有3个碱基能与目的dna片段完全互补(即snp不应在靠近探针两端的3个碱基范围内)，或至少2个c或g碱基与目的dna序列互补，以保证待测位点与探针不互补时，探针两端有一定的结合能力；

③“茎”一般长5-7对核苷酸，可部分或全部由人为加入的碱基形成，cg碱基含量占75-100％，以使“茎”的tm比qpcr的ta高7-10℃，荧光分子一端不宜紧接g碱基，避免后者的荧光淬灭作用；

④5’末端标记荧光分子，3’末端标记淬灭分子；

⑤整个分子信标探针全长一般25-35个核苷酸，不能与引物形成可以引发扩增的稳定二聚体，且探针和引物与目的dna的互补结合区域没有重叠部分；

⑥引物扩增目的dna片段的产物长度宜在200bp以内，最好短于150bp；

⑦对应于同一条dna单链上的引物和探针具有相近的tm值，且高于另一条引物tm值的5-8℃；

⑧引物符合上述要求外，再符合其余的引物设计常规法则。

其中，⑤⑥⑦三条法则连同后文qpcr反应体系(见后文表5)中提高探针及其互补链引物浓度(即：提高探针互补链产量的非对称pcr)的策略，都有助于增强探针与目标链结合的竞争优势。根据这些条件，以gc蛋白质编码的正义dna链为模板，同时覆盖rs7041和rs4588两个snps的候选探针信息可能的探针序列如表1。类似地，也可根据正义链的互补dna链为模板设计探针。

表1

¹pta1-5、ptc1-2和pgc1分别对应的单倍体型为t-a、t-c和g-c。

²下划线碱基为snps，方框内碱基为发夹结构。

³以tmutilityv1.3软件计算的tm值，条件为：探针0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、总dntp0.8mm。

⁴以primerexpress3.0、dnafoldingform等软件的分析发现。

遵循上述原则，以primerpremier5软件在第一个snp上游100bp范围内设计上游引物，在第二个snp下游100bp范围内设计下游引物，引物长度预设(25±5)bp，产物长度预设80-150bp，搜索严格程度从“非常高(veryhigh)”开始，其余参数为默认值，没有符合条件的引物对；然后搜索严格程度设为“高(high)”，出现10对引物。表2列出了ta值最接近55℃的一对引物及产物评分高过此对引物扩增产物评分的全部引物对。

表2

¹以rs7041上游100bp的碱基为1开始计算位置，后同。

²以tmutilityv1.3软件计算的tm值，条件为：引物0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、总dntp0.8mm。

以在线软件ncbiprimer-blast和primer3在rs7041上游100bp范围内搜索上游引物、在rs4588下游100bp范围内搜索下游引物，参数设置均为默认，对更多引物的位置做扩展检索。表3列出了候选引物群的代表性序列。

表3

¹粗体下划线字母代表同一引物群在共有位置上的片段。上游引物群i的共同片段也存在于表2；下游引物群ii与表2中的下游引物也具有共同片段。

²共同位置片段位于中部的其余引物未再列出。

可见，rs7041上游100bp的适宜引物都具有一段长9bp的共同位置5’-ggcagagcg-3’；rs4588下游100bp的适宜引物有两群，一群具有6bp的共同位置5’-ggaggc-3’，另一群具有8bp的共同位置5’-gaggaggt-3’。

3)最佳探针与引物的理论筛选

以primerexpress3.0的引物探针测试工具(primerprobetesttool)对上述引物对和探针进行分析，从自身发夹(hairpin)、自身二聚体(selfdimers)和交叉二聚体(crossdimers)的形成情况滤除欠佳的组合，保留f1-r3和f3-r4两对引物(表2中的粗体字)。在qpcr的ta为55℃及体系组分构成的条件下，探针同链的(上游)引物tm宜在62-65℃之间，探针互补链的(下游)引物tm宜在58-60℃之间，并且不能与探针形成可以扩增的二聚体，因此，初步考虑f3与r3组成引物对，并进一步手动调整和评估。满足条件的上游引物命名为gc-f(seqidno:4：ggtttttcagactggcagagcgacta)、下游引物记为gc-r(seqidno:5：gaggtgagtttatggaacagca)，见表4。由于一条荧光探针的价格大约在900-1200元，因此，更需对其事先做好理论分析，挑选最优的一条合成。

对表1中pta1、pta2和ptc1三条待进一步评估的探针，在其末端加入可以形成发夹结构的适当碱基，利用在线分析工具dnafoldingform(http://unafold.rna.albany.edu/)进行“茎环”结构的质量评估。在特定熔解曲线分析条件下，分子构象合理而稳定(自由能差值dg<0)的分子信标探针，其预测的二级结构主要满足以下条件：①有正确的“茎”结构，保证荧光分子和淬灭分子空间靠近；②不宜出现7对以上碱基互补的“茎”结构。如不满足上述条件，需调整探针位置或/和构成“茎”的碱基。

本发明拟用熔解曲线分析的ta为40℃、na⁺50mm、mg²⁺2mm，该条件下，以pta1、pta2或ptc1为“环”主体的分子信标探针的合理而稳定的二级结构如下(小写字母为人为加入的碱基)：

三种分子信标探针对应的核苷酸序列如下：

seqidno:1：cacagctgatgccacacccaaggaactgtg；

seqidno:2：cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg；

seqidno:3：ctggtctgatgccacacccaaggaaccga。

可见，pta1(seqidno:1)、pta2(seqidno:2)和ptc1(seqidno:3)三者均可能构成有效的分子信标探针。本发明随机选了pta1送公司合成，并在5’端连接fam荧光分子，3’端连接dab荧光淬灭分子，命名为gc-p，见表4。

表4

¹粗体下划线是与表2、表3中上游或下游引物具有相同位置的片段，中括号内碱基为snps，小写字母为手动加入、构成“茎”结构的碱基。

²以tmutilityv1.3软件计算的tm值，条件为：oligo0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、总dntp0.8mm。gc-p的tm计算不含两端手动加入的碱基(小写字母)。

³探针5’端连接fam荧光分子，3’端连接dab荧光淬灭分子；该探针与上游引物对应于同一条dna链。互补序列为23bp，全长30bp。

经过上述筛选得到的引物和探针对应于qpcr扩增片段(123bp)的位置如下：qpcr扩增产物全长123bp。灰色涂抹的碱基为上游引物序列和下游引物反向互补序列，方框内的碱基为探针部分序列，中括号内的碱基为多态性位点。

此外，表1-表3中的全部引物(或其互补序列)和探针(或其互补序列)也可通过适当组合、评估，人工增减碱基，以达到本发明的目的，这里不再一一分析、验证，具体地，凡是具有表4中相同性能的引物和探针都在本发明保护范围内。

实施例2gc基因snps位点检测

1)dna样本制备：根据全血dna提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司的全血dna提取试剂盒，货号dp318-03)的操作说明提取待检测的dna样品，用微量分光光度计(ge公司的nanovueplus)检测样本在280nm和260nm波长下的比值，由此吸光度值计算的dna浓度。

2)qpcr实验测试引物和探针：按表5中的qpcr成分配制反应试剂，并按表6的qpcr反应程序进行预实验。三个优选条件：①热启动dna聚合酶，确保引物、探针分别与互补链杂交的特异性；②非对称产物扩增，提高一侧引物浓度以提高分子信标探针互补链的产量。③降落pcr(touch-down)程序提高扩增的特异性。本实验的qpcr仪为roche480ii，同时检测rs7041和rs4588组成的6种基因型，荧光信号检测波长为465-510nm，图1为roche480iiqpcr软件生成的熔解曲线峰原始图：图中包含6种基因型的荧光曲线：1：gc-1s/1s；2：gc-1f/1f；3：gc-2/2；4：gc-1s/1f；5：gc-1s/2；6：gc-1f/2；横坐标为温度，纵坐标为检测到的荧光信号相对值。图2为原始数据处理的结果图。从图1和图2可知，本实施例的gc基因snps位点检测方法，只需要根据荧光信号在熔解曲线程序中出现的峰型，即可判断gc的基因型是哪一种(见表7，基因型判断表：rs7041和rs4588的3种单倍体基因型及其组合的6种二倍体基因型)。因此，整个检测过程步骤简单、耗时少、成本低，在临床与预防医学的分子流行病学相关工作中非常实用。

表5

¹taq热启动酶(takarataqtmhotstartversion)试剂盒，货号r007a，takara(大连)公司，含：takarataqhs酶、10×pcrbuffer(mg²⁺plus)和dntpmixture(各2.5mm)。

²分子信标探针与上游引物对应于同一条dna链上，分子信标探针浓度和下游引物的用量高于上游引物，确保在与下游引物pcr产物互补结合过程中，探针比上游引物pcr产物更具竞争优势。

表6

¹表中各中文名词对应于roche480iiqpcr操作软件的英文依次如下：程序名称(programname)；分析模式(analysismode)；循环数(cycles)；目标温度(target)；时间(hold)；斜率(ramprate)；第二目标温度(sectarget)；步长(stepsize)；信号采集次数(acquisitions)；采集模式(acquisitionmode)；预变性(pre-incubation)；无(none)；降落pcr(touch-down)；扩增(amplification)；定量(quantification)；单次(single)；熔解曲线(meltingcurve)；连续(continuous)；冷却(cooling)。

²仪器设置：检测模式(detectionformat)为多色探针(multicolorhydro-probe)；定制(customize)：荧光(fluos,465-510)；模块规格(blocksize)：96孔；反应体积(reactionvolume)：25μl。

³表格中的“—”表示无需设置。

⁴连续监测40-80℃升温区间的荧光信号，分子信标探针从发夹结构打开，并结合到互补dna链上，荧光信号达到最大值。随着温度升高，有错配的探针-dna杂交链会在较低温度下解链，形成熔解曲线峰值；而匹配程度高的探针-dna杂交链会在较高温度下解链。

表7

3)将pcr产物送往商业服务公司进行测序，以验证分子信标qpcr的分型结果。测序结果如图3所示，6种基因型的样品各3个测序的结果与本发明技术分析的结果一致，图3将6种基因型的结果各列举了一例。

4)大量样本检测：按照上述预实验成功的实验条件，进行大量样本的基因分型检测，检测结果如图4所示。

在研究gc基因与人群多种慢性病的关系时，分析rs7041和rs4588两个snps构成的gc-1f、gc-1s和gc-2基因型是一项重要内容。利用我们发明的这种方法，我们曾从某市人群流行病学研究中纳入分析了1906名18-83岁成年女性gc-1f、gc-1s和gc-2基因型的频率差异。rs7041和rs4588两个snps基因型分布的hardy-weinberg平衡检验证实样本具有良好代表性。表8显示了不同血浆25ohd浓度下gc的6种基因型频率：gc-2/2和1f/2的基因型频率随着血浆25ohd浓度的升高而下降(p<0.05)；gc-1s/1s和1s/1f的基因型频率却随着血浆25ohd浓度升高而升高(p<0.05)。表9显示了不同年龄段、不同血浆25ohd浓度下gc的3种等位基因型频率：gc-2等位基因型的频率随着血浆25ohd浓度的升高而下降(p<0.05)；gc-1s等位基因型的频率却随着血浆25ohd浓度升高而升高(p<0.05)。这就提示，gc-2等位基因型是维生素d缺乏的危险因素，而gc-1s等位基因型是保护因素。已知gc-2与较低的血循环gc蛋白浓度相关，且与维生素d及其代谢产物的结合能力低于gc-1f和1s。因而，gc-2通常导致血循环较低的25ohd浓度。本发明方法检测到的这组人群的结果与此前研究一致，也说明该方法在应用上有效。

表8

¹以血浆25ohd(nmol/l)为判断标准，缺乏：-<50；不足：50-<75；充足：≥75。

表9

¹以血浆25ohd(nmol/l)为判断标准，缺乏：-<50；不足：50-<75；充足：≥75。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>深圳市慢性病防治中心

<120>分子信标探针及引物对、gc基因snps位点检测方法

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

cacagctgatgccacacccaaggaactgtg30

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg32

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

ctggtctgatgccacacccaaggaaccga29

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ggtttttcagactggcagagcgacta26

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

gaggtgagtttatggaacagca22