本发明涉及一种检测结直肠癌miRNA表达水平的引物探针组和检测产品，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：microRNA是一类内源性、高度保守的非编码小分子RNA，由单链RNA前体分子加工形成，长度一般为18～23bp，合成时首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录成原始miRNA，然后由核糖核酸酶Ⅲ家族的Drosha酶切割形成miRNA前体，再经核糖核酸酶Ⅲ家族的Dicer酶加工最终形成成熟的miRNA。人体内存在大量miRNAs，这些成熟的miRNA能够与RNA诱导沉默复合物结合，并与与其靶标基因mRNA的3’端非编码区结合，调控转录后的翻译过程，从而调控对应靶蛋白的表达，组成了一系列的RNA调控网络，在肿瘤发生起着重要的作用。有些miRNA在肿瘤中上调，起类似癌基因作用，有些miRNA在肿瘤中下调，起抑癌基因的作用，对细胞的功能发生较大的影响。一种miRNA可以调控多个靶基因，一个把标基因也可以被多种miRNAs调控，通过调节靶基因蛋白表达影响细胞的增值、分化、凋亡、侵袭等过程，多项研究表明miRNA在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达失调。由于miRNA参与肿瘤的发生发展过程，以miRNA表达水平预测化疗和放疗疗效的研究也逐步展开。约四分之一的II期结直肠癌会复发，多项研究表明，血清miR-21、miR-92、miR-29a可作为不同种族、不同地域结直肠癌患者早期诊断的生物标志物。研究表明，结直肠癌患者血清miR-21、miR-29a表达显著上调，可用于早期阶段识别高风险结直肠癌患者，miR-21的高表达与肿瘤体积、远处转移密切相关，并且患者的预后较差，同时也用于Ⅱ期结直肠癌患者的预后评估(YamadaA，ClinCancerRes.2015Sep15；21(18):4234-42)(ChangPY,Oncotarget.20191Mar1；7(9):10663-75)。Zhu等研究发现，与健康对照着血清中miR-92表达相比，结直肠癌患者血清中miR-92表达显著上调(ZhuY，CancerBiomark.20191Feb23；191(2):259-64)。miRNA受内源性核糖核酸酶的保护，越来越多的研究显示，在很多肿瘤患者的外周血中都具有特异性循环miRNA的表达，血清或血浆放置在常温24h以上或在强酸强碱环境中以及反复冰冻及融解样本多次也不影响miRNA的稳定性，不同肿瘤显示出各自特异性miRNA表达谱，具有明显的组织特异性，这些特征都暗示了血清、血浆中的miRNA可作为生物学标志物的可能性和可行性本。循环中的miRNA不仅来自脱落细胞，也可能是机体执行调控功能而主动分泌的，这写miRNA组合可用于结直肠癌的早期诊断。这些结果显示，检测miRNA的特异性表达不仅有助于肿瘤的早期诊断，还可用于患者的预后判断。这些研究充分证实，血清及血浆miRNA的测定是一个检测癌症生物学标志物很有前途的领域。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速、便捷、准确地检测作为结直肠癌早期诊断标志物的miRNA的表达水平的结直肠癌检测引物探针及其试剂盒。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种结直肠癌检测引物探针，包括用于逆转录hsa-mir-21的茎环逆转录引物a，用于逆转录hsa-mir-29a的茎环逆转录引物b，用于逆转录hsa-mir-92的茎环逆转录引物c，用于逆转录hsa-mir-191的茎环逆转录引物d，用于检测hsa-mir-21的上游引物a和探针a，用于检测hsa-mir-29a的上游引物b和探针b，用于检测hsa-mir-92的上游引物c和探针c，用于检测hsa-mir-191的上游引物d和探针d，以及用于检测hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92和hsa-mir-191的通用下游引物；所述hsa-mir-21、hsa-mir-29a和hsa-mir-92是标志物，所述hsa-mir-191是内参；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述上游引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探针d的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述茎环逆转录引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述茎环逆转录引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述茎环逆转录引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述茎环逆转录引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；所述探针a和探针b的5’端设有一种荧光报告基团，所述探针c和探针d的5’端设有另一种荧光报告基团，所述探针a、探针b、探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为2μM/L～4μM/L；所述探针a在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.15μM/L，所述探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L～0.5μM/L，所述探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.17μM/L，所述探针d在反应体系中的终浓度为0.18μM/L～0.5μM/L。上述探针a在反应体系中的终浓度为0.15μM/L，所述探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述探针c在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述探针d在反应体系中的终浓度为0.2μM/L。上述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.8μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为3μM/L。上述各茎环逆转录引物在逆转录体系中的终浓度是50nM/L。上述探针a和探针b的5’端的荧光报告基团是FAM，所述探针c和探针d的5’端的荧光报告基团是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述引物探针的结直肠癌检测产品。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种结直肠癌检测试剂盒，包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和miRNAs引物探针混合液，以及用于进行RNA逆转录的茎环逆转录引物混合液；所述miRNAs引物探针混合液中包括用于检测hsa-mir-21的上游引物a和探针a，用于检测hsa-mir-29a的上游引物b和探针b，用于检测hsa-mir-92的上游引物c和探针c，用于检测hsa-mir-191的上游引物d和探针d，以及用于检测hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92和hsa-mir-191的通用下游引物；所述茎环逆转录引物混合液中包括用于逆转录hsa-mir-21的茎环逆转录引物a，用于逆转录hsa-mir-29a的茎环逆转录引物b，用于逆转录hsa-mir-92的茎环逆转录引物c，用于逆转录hsa-mir-191的茎环逆转录引物d；所述hsa-mir-21、hsa-mir-29a和hsa-mir-92是标志物，所述hsa-mir-191是内参；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述上游引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探针d的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述茎环逆转录引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述茎环逆转录引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述茎环逆转录引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述茎环逆转录引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；所述探针a和探针b的5’端设有一种荧光报告基团，所述探针c和探针d的5’端设有另一种荧光报告基团，所述探针a、探针b、探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为2μM/L～4μM/L；所述探针a在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.15μM/L，所述探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L～0.5μM/L，所述探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.17μM/L，所述探针d在反应体系中的终浓度为0.18μM/L～0.5μM/L。上述探针a在反应体系中的终浓度为0.15μM/L，所述探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述探针c在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述探针d在反应体系中的终浓度为0.2μM/L；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.8μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为3μM/L；所述各茎环逆转录引物在逆转录体系中的终浓度是50nM/L；所述探针a和探针b的5’端的荧光报告基团是FAM，所述探针c和探针d的5’端的荧光报告基团是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。上述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX和缓冲液；所述液滴稳定剂中包括矿物油。上述结直肠癌检测试剂盒反应时，反应体系中包括数字PCR预混液10体积，miRNAs引物探针混合液2体积，液滴稳定剂2体积，cDNA模板1体积，灭菌超纯水5体积。本发明具有积极的效果：(1)本发明的结直肠癌检测试剂盒采用多重探针数字PCR技术，基于Taqman探针原理，对引物探针进行了优化设计，针对多个miRNA分别使用不同的荧光素标记的探针，检测时带不同荧光的液滴将被相应识别出来，分别被计数。在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合的配比，可以一次同时检测4个miRNA的表达水平。本发明解决样本中miRNA含量低、样本量少的问题，具有更好的组内稳定性，能够更好地用于疾病的无创检测。本发明的结直肠癌检测试剂盒4个miRNA联合作为结直肠癌早期诊断标志物的诊断准确率为96％，可以成为结直肠癌早期诊断的有效手段。(2)本发明的结直肠癌检测试剂盒与一般的定量相比，不用设置阳性对照，也不需要设置标准品，一般的检测技术是定性检测，本发明的技术可以达到真正意义上的绝对定量，检测出低至1个拷贝数模板量，克服了qPCR不具有精确定量的缺点。本发明对血清中miRNA进行定量检测，不依赖于扩增曲线的阈值(CT值)进行定量，不依靠标准曲线达到绝对定量的目的，有很好的准确度和重现性，不受扩增效率的影响。(3)本发明的结直肠癌检测试剂盒对样本溶液采用微滴化处理，减少背景干扰，根据荧光类型、荧光微滴个数结果，能够直接判读拷贝数，操作简化，降低检测成本，以前的检测技术方法的灵敏度一般在1％～50％之间，而本发明的实验方法的灵敏度可以达到0.1％，检测样本中miRNA的绝对量和比例。附图说明图1为用本发明的试剂盒对结直肠癌患者血浆样本进行检测的结果图。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。一、试剂盒的组成。本实施例的结直肠癌检测试剂盒，包括数字PCR预混液、液滴稳定剂、miRNAs引物探针混合液和茎环逆转录引物混合液。试剂盒各成分如表1所示。表1试剂盒成分表试剂盒成分分装试剂公司数字PCR预混液1管Lifetechnologies液滴稳定剂1管RaindancetechnologiesmiRNAs引物探针混合液1管百力格茎环逆转录引物混合液1管百力格上述表1中试剂盒各组分的说明如下：1)数字PCR预混液的主要成分包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX、缓冲液等(由Lifetechnologies公司提供，货号：1508099)。2)液滴稳定剂的主要成分是矿物油，(由Raindancetechnologies公司提供，货号：30-00826)，主要作用是微滴化处理过程将反应体系形成油包水小液滴。3)miRNAs引物探针混合液中检测的miRNA分别是hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92以及内参hsa-mir-191。miRNAs引物探针混合液包括hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92、hsa-mir-191各自的上游引物，hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92、hsa-mir-191各自的探针，以及hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92、hsa-mir-191共用的通用下游引物。hsa-mir-21、hsa-mir-29a和hsa-mir-92是标志物，hsa-mir-191是内参。本发明选择的内参是经过样本验证的在结直肠腺癌、腺瘤和健康对照组中表达量无显著性差异，并且在结直肠癌的不同分期患者中表达量也无显著性差异。4)茎环逆转录引物混合液包括hsa-mir-21、hsa-mir-29a、hsa-mir-92和hsa-mir-191各自的茎环逆转录引物。本发明中的所有引物和探针都是基于miRNA在miRBase数据库的序列信息，如表2所示。表2miRNA信息表GeneAccessionSequence(5’——3’)hsa-mir-21MIMAT0000076uagcuuaucagacugauguugahsa-mir-29aMIMAT0000086uagcaccaucugaaaucgguuahsa-mir-92MIMAT0000092uauugcacuugucccggccuguhsa-mir-191MIMAT0000440caacggaaucccaaaagcagcug为设计引物方便，把在数据库中检索的到的miRNA序列中的U替换成T，替换后的结果如表3所示。表3miRNA碱基替换后序列信息表GeneAccessionSequence(5’——3’)hsa-mir-21MIMAT0000076tagcttatcagactgatgttgahsa-mir-29aMIMAT0000086tagcaccatctgaaatcggttahsa-mir-92MIMAT0000092tattgcacttgtcccggcctgthsa-mir-191MIMAT0000440caacggaatcccaaaagcagctg通用下游引物是以逆转录引物为模板设计的GC含量、二聚体情况等达到最佳的一段序列。上游引物是与通用下游引物配对的相关参数达到最佳的一段序列。茎环逆转录引物序列是将miRNA的3’端后4至6位碱基反向互补序列添加到经典颈环结构的3’端形成的序列，主要用于抽提RNA后的miRNA逆转录。选择基于茎环引物的miRNA定量，茎环法具有特异性强，灵敏度高、miRNA前体的背景干扰小、线性范围广、效率高等优点。茎环逆转录引物由一段与miRNA特异性互补序列和一段较长的通用茎环引序列组成，通用茎环引序列的核苷酸序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac。miRNAs引物探针混合液中的上游引物、探针、通用下游引物，以及茎环逆转录引物混合液中的茎环逆转录引物的核苷酸序列如表4所示。表4引物和探针序列表探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM或VIC，探针的3’端标记的淬灭基团是BHQ1。本实施例中hsa-mir-21和hsa-mir-29a的探针的5’端标记的是FAM，hsa-mir-92和hsa-mir-191的探针的5’端标记的是VIC。探针引物干粉由百力格生物技术有限公司合成，母液由干粉加入灭菌超纯水稀释而成，引物和探针混合液均由母液加入灭菌超纯水稀释而成，包括上游引物、探针、通用下游引物，由于多重PCR可能产生引物间的抑制作用和扩增效率的不稳定性，不同的引物探针使用浓度存在差异，本发明优化实验条件使引物探针使用浓度组合效果最佳，上游引物的使用浓度各为1μM/L～15μM/L，最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，优选地，上游引物在最终反应体系中的浓度为0.8μM/L；通用下游引物使用浓度为20μM/L～40μM/L，最终反应体系中的浓度为2μM/L～4μM/L，优选地，通用下游引物在最终反应体系中的浓度为3μM/L；各探针使用浓度为1μM/L～5μM/L，最终反应体系中探针的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，hsa-mir-21探针在最终反应体系中的浓度为0.15μM/L、hsa-mir-29a探针在最终反应体系中的浓度为0.2μM/L、hsa-mir-92探针在最终反应体系中的浓度为0.14μM/L、hsa-mir-191探针在最终反应体系中的浓度为0.2μM/L。茎环逆转录引物在逆转录体系中的终浓度50nM/L。二、试剂盒的使用方法。本实施例的结直肠癌检测试剂盒的具体检测步骤如下：1、RNA提取用抗凝管采集待测结直肠癌患者样本和健康对照样本，用德国Qiagen公司提供的血清总RNA提取试剂盒(货号：51504)，按照试剂盒操作说明书抽提血清中的RNA。通过Thermo-Fisher公司3.0核酸蛋白荧光定量仪，测定样本RNA浓度和纯度，抽提的RNA最终加入逆转录反应体系中。2、RNA逆转录采用美国Invitrogen公司生产的逆转录试剂盒(货号：18080085)，根据试剂盒说明书配置逆转录体系，取步骤1中抽提的RNA和茎环逆转录引物混合液，进行miRNA逆转录，获得cDNA模板，将逆转录后的cDNA产物用灭菌超纯水稀释50倍，稀释后的cDNA模板作为数字PCR反应的模板，放置4℃冰箱待用。3、数字PCR反应液制备根据表5中的PCR反应体系，取试剂盒中20μl的数字PCR预混液混合、4μl的miRNAs引物探针混合液，加入2ul的逆转录稀释后的cDNA、4μl的液滴稳定剂，加入灭菌超纯水补至40μl，制得数字PCR反应液。表5PCR反应体系表反应成分加入浓度加入体积数字PCR预混液2×20ulmiRNAs引物探针混合液---4ul液滴稳定剂10×4ulcDNA模板---2ulddH2O---to40ul4、PCR反应微滴制备将微滴发生板放入8通道微滴生成器中，用Raindance公司生产的微滴生成器RainDropSource对样本进行微滴化处理，将数字PCR混合液制作成PCR微反应液滴，形成500～800万个油包水液滴。本实验的反应体系通过微滴发生器形成上百万个皮升级大小的油包水小液滴后再进行PCR反应，每个微滴中会含有1个或者不含目的基因的模板。5、PCR扩增采用博日公司的PCR扩增仪对生成的微滴进行PCR扩增，扩增的反应程序如表6所示。表6PCR反应程序表优选地，数字PCR扩增的条件为：预变性阶段的条件95℃，10min；循环1，40个循环，条件为95℃15s，60℃45s；循环2条件为98℃10min；循环3条件为12℃30min。6、微滴检测PCR反应结束后，将8联管置于微滴分析仪中，用Raindance公司生产的微滴分析仪RainDropSense对每个微滴逐个检测，含有荧光信号的微滴标记为1，不含荧光信号标记为0，再对微滴计数，软件自动分析，通过泊松分布公式计算miRNA的拷贝数(液滴数)。泊松分布公式如下：7、实验结果判定FAM信号通道检测结果分别是hsa-mir-21和hsa-mir-29a的拷贝数，VIC信号通道检测结果分别是hsa-mir-92和内参hsa-mir-191的拷贝数。待测样本miRNA表达判断：若(待测样本标志物miRNA拷贝数-待测样本内参miRNA拷贝数)>(健康对照样本miRNA拷贝数-健康对照样本内参miRNA拷贝数)，则待测样本的miRNA表达上调。若(待测样本标志物miRNA拷贝数-待测样本内参miRNA拷贝数)<(健康对照样本miRNA拷贝数-健康对照样本内参miRNA拷贝数)，则待测样本的miRNA表达下调。三、应用例采用本实施例的结直肠癌检测试剂盒检测结直肠癌患者的血浆样本，通过用Raindance公司的微滴分析仪RainDropSense对每个微滴逐个检测，对微滴计数，软件自动分析，通过泊松分布公式计算miRNA的绝对拷贝数。得到的检测结果图如图1所示，hsa-mir-21圈中是hsa-mir-21目的片段的液滴数，hsa-mir-29a圈中是hsa-mir-29a目的片段的液滴数，hsa-mir-92圈中是hsa-mir-92目的片段的液滴数，hsa-mir-191圈中是hsa-mir-191目的片段的液滴数。emptydroplets圈中是不包括以上四个目的片段的液滴数，可以明显看到miRNA目的片段的区域界线清晰，仅通过一次反应即可统计出结直肠癌患者的血浆样本的miRNA拷贝数，再与健康对照样本miRNA拷贝数比较，准确的判断样本的miRNA表达水平，有助于结直肠癌患者的早期诊断。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。SEQUENCELISTING<110>上海赛安生物医药科技有限公司<120>结直肠癌检测引物探针及其试剂盒<130>无<160>13<170>PatentInversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1gcttatcagactgatgttg19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2gcaccatctgaaatcggt18<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>3tattgcacttgtcccgg17<210>4<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>4aacggaatcccaaaagca18<210>5<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>5gtcgtatccagtgcgaa17<210>6<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>6ctgcactggatacgactcaac21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7cggttagtcgtatccagtgc20<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>8tcccggcctgtgtcgtatc19<210>9<211>20<212>DNA<213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