一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器检测领域，特别涉及一种基于双纳米金探针检测标志物的 蛋白芯片。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗死（AMI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）的严重类型。 据世界卫生组织（2012)统计每年大约有1. 75亿人死于心血管疾病，占全球非传染性疾病 死亡人数的46%。AMI是目前全世界范围内男女发病、致死的主要原因之一，早期诊断对病 人的分类管理和预后至关重要。目前对疑似急性冠脉综合征（ACS)的初步评价主要是结 合病史、心电图改变及生化指标测定。心电图是一种简单快捷的方法，但在AMI早期仅有 50% -60%患者显示有特征性改变。人群中尤其是老年人或合并其他疾病如糖尿病、充血性 心力衰竭等由于ACS症状不典型造成误诊率、漏诊率的现象时有发生。因此，心肌损伤标志 物在AMI早期诊断、监控、预后和危险分层方面发挥着基础性的作用。
[0003] 为满足疾病诊断需求、节省医疗成本，目前已研制出多种生物传感 器检测心肌损伤标志物，包括光电二极管芯片、荧光技术检测、表面等离子体 共振等[Vittorini S.,Clerico A·, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine [J], 2008, 46(6), 748-763] , [Gobi K. V. , Tanaka H. , Shoyama Y. , Miura N. , Sensors and Actuators B:Chemical[J], 2005, 111, 562-571]、[Nakamura H. , Karube I. ,Analytical and bioanalytical chemistry [J], 2003, 377 (3) ,446-468]，而实验室 诊断则主要依赖ECLIA。前三种方法检测灵敏度高，但仪器设备复杂、光学组件昂贵、 所需条件严格，限制 了其应用推广[Mohammed M.I·，Desmulliez M.P.Y·，Biosensors and Bioelectronics[J]，2014,61，478-484]、[Gul 0. , Calay E.,Sezerman U. , Basaga H. , Gurbuz Y. , Sensors and Actuators B: Chemical[J],2007, 125 (2), 581-588]> [Matveeva E.G. , Gryczynski Z.,Lakowicz J.R. , Journal of immunological methods [J]，2005, 302 (I)，26-35]。后者为目前临床上检测心肌标志物最常用的方法，该 体系需要精密的分析技术如基于脉冲式的伏安法以及电化学阻抗谱方能实现高灵敏检测， 另外由于相邻电极活化性能的干扰导致其无法对多种标志物进行联合检测[Han K.N.，Le T. H. , Pham X. H. , Huynh-Nguyen B. C. , Kim J. H. , Ko E. , Kwon Η. T. , Seong G. H. , Sensors and Actuators B:Chemical[J], 2015, 207, 470-476]〇
[0004] 纳米金作为比色分析指标因独特的光学特性、良好的化学稳定性、生物相容性、 无毒性等备受关注，其能够与多肽、蛋白质、适配体、核酸、肽核酸（PNAs)等多种生物分子 共价或非共价结合，从而实现对目的成分的检测[Zhu Z.，Ravelet C.，Perrier S.，Guieu V. ,Fiore E.，Peyrin E.，Analytical chemistry[J]，2012,84(16), 7203-7211]。然而比 色技术由于缺乏合适的信号放大策略灵敏度低限制了检测微量蛋白的能力。近来Peyrin 等人[Liu J. , Wang C. , Jiang Y. , Hu Y. , Li J. , Yang S. , Huang C. Z. , Analytical ch emistry[J]，2013, 85(3)，1424-1430]用单链结合蛋白（SSB)作为小分子荧光偏振分 析的信号增强器，YANG 等人[Tabakman S. Μ·，Chen Ζ·，Casalongue H. S.，Wang Η·，Dai Η.，SmalI [J]，2011，7(4)，499-505]用石墨烯辅助信号放大提高ATP检测灵敏度。这些方法 在带来高灵敏度的同时加大了非特异蛋白质的吸附，使背景信号增强、假阳性率升高。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯 片，该芯片40min内可对多种蛋白进行高灵敏联合检测，敏感快捷、成本低、小型化、不需要 复杂的光学组件、所用样本量极少，在生物医学及化学分析等方面均有广阔的应用前景。
[0006] 本发明的一种基于双纳米金探针检测标志物的蛋白芯片，由含有捕获抗体的蛋白 芯片、标记检测抗体和DNA探针1的检测探针以及标有DNA探针2的信号探针组成；其中， 所述捕获抗体、检测抗体为TnI、MY0、HFABP相应的捕获抗体、检测抗体，DNA探针1 (检测探 针）的序列为 5' -SH-(CH2) 3TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG-3'，DNA 探针 2 (信号探针）的 序列为 5' -SH-(CH2)3TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC-3'。
[0007] 所述蛋白芯片的制备方法为：将cTnI、MY0、HFABP捕获抗体及羊抗鼠 IgG抗体与蛋 白点样液混合，通过芯片点样仪点样；点样完毕后将芯片晾干，经微阵列稳定液处理固定， 干燥后真空包装保存备用。
[0008] 所述检测探针的制备方法为：取AuNPs，用K2CO3调整pH ;依次加入CTnI检测抗体、 MYO检测抗体、HFABP检测抗体；恒温振荡，然后加入DNA探针1，充分混匀，离心、重悬，保存 备用。
[0009] 所述信号探针的制备方法为：取AuNPs，离心，取DNA探针2,加入去离子水重悬纳 米金，静置，加入PB和NaCl，充分混匀静置；再加入PB/NaCl混合液离心，加入ro/NaCl混 合液重悬，保存备用。
[0010] 所述信号探针使用时的加入量为6 μ L。
[0011] 本发明构建的蛋白微阵列体系基纳米技术与核酸杂交于一体，人工合成的寡核苷 酸链遵循严格的碱基互补配对原则，借助于纳米金成核反应原理，将两种纳米金探针高效、 特异性的结合从而提高蛋白检测的灵敏度。构建的放大体系与目前相关资料报道结果相 比，背景信号弱，反应时间短，检测灵敏度升高1~2个数量级。同时操作所需设备简单、成 本低、短时间内可同时对多种蛋白进行快速、高灵敏度检测，为临床疾病的诊治和预后开辟 了新道路。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明40min内可对多种蛋白进行高灵敏联合检测，其中肌钙蛋白I (cTnl)检测 限为10pg/mL，与临床电化学发光法（ECLIA)灵敏度相当；肌红蛋白（MYO)与新型脂肪酸结 合蛋白（HFABP)检测限分别为640pg/mL和10pg/mL，与ECLIA及酶联免疫吸附法（ELISA) 相比，灵敏度大大提高；敏感快捷、成本低、小型化、不需要复杂的光学组件、所用样本量极 少，在生物医学及化学分析等方面均有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明的检测过程及原理图；
[0015] 图2为标记前后的吸收光谱；
[0016] 图3为纳米金探针标记的电泳表征结果；
[0017] 图4为检测探针㈧与信号探针⑶的加入量的优化结果；
[0018] 图5为蛋白芯片信号放大前（上）和信号放大后（下）的结果；
[0019] 图6为蛋白芯片检测心肌损伤标志物的特异性；其中，A加入样品为PBS，B加入样 品为HFABP抗原标准品，C加入样品为cTnl抗原标准品，D加入样品为MYO抗原标准品；
[0020] 图7为HFABP、cTnl、MYO抗原标准品的标准曲线。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0022] cTnl、MYO、HFABP相应捕获抗体、检测抗体及抗原购自Hytest公司；15nm胶体金 溶液（AuNPs)购自上海水源生物公司；4-吗啉乙磺酸（MES)，三羟甲基氨基甲烷（Tris)，乙 二胺四乙酸（EDTA)，四氯金酸，聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，牛血清白蛋白（BSA)，Tween-20购自 Sigma-Aldrich 公司；微阵列稳定液（microarray stabilizer)购自 SurModics 公司；磷酸 盐缓冲液（lOmmol/L PBS，pH7. 4)，PBST 洗液（lOmmol/L PBS，0. 05% Tween20, ρΗ7· 4);杂 交液（lmmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl);胶体金重悬液（0· lmmol/LPB, 2· 5%蔗糖，0· 4% BSA，0. 1% PVP，0. 3% Tween20, ρΗ7· 4);金染液（lOOmmol/L 四氯金酸， 30% H2O2, 25mmol/L MES)。配制以上溶液所需试剂 K2C03,NaCl，KCl，Na2HP04· 12H20，KH2P04， HCl，蔗糖购自上海凌峰化学试剂有限公司。实验用水为MiIIi-Q超纯水（18. 2ΜΩ/cm)，醛 基片购自上海百奥科技有限公司，Human HFABP ELISA试剂盒购自荷兰Hycult biotech公 司，两条互补DNA探针由TaKaRa公司合成。
[0023] 实施例1
[0024] (1)蛋白芯片的制备：将cTnI、MY0、HFABP捕获抗体及羊抗鼠 IgG抗体（质控点） 与蛋白点样液按体积比1:1混合，通过芯片点样仪固定在醛基化修饰的玻片上，点样间距 400 μ m，点样直径80 μ m，点样量0· 5 μ L，每种蛋白重复点样6次，共点样3排。点样完毕后 将芯片置于25°C 12h晾干，经微阵列稳定液处理固定，干燥后真空包装4°C保存备用。
[0025] (2)检测探针制备：取ImL 15nmAuNPs三管，用0· 2mol/L K2CO3调整pH分别为 8· 0、8· 0、8· 5 ;依次加入cTnl检测抗体L