一种表面修饰分子印迹固相微萃取探针及其制备与应用的制作方法

本发明属于萃取探针技术领域，更具体地，涉及一种表面修饰分子印迹固相微萃取探针及其制备与应用。

背景技术：

孔雀石绿(malachitegreen,mg)又称苯胺绿、盐基块绿等，是一种阳离子型的偶氮化合物，属于三苯甲烷类染料，广泛用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色。在以往的渔业生产中，孔雀石绿被用作驱虫剂、杀虫剂和防腐剂大量地应用于防治水产动物的水霉病、鳃霉病和寄生虫病等，但其具有持久性、生物毒性和生物蓄积性等持久性有机污染物的典型特征，近年来，孔雀石绿已成为生物、食品和环境分析领域普遍关注和研究的热点。目前，孔雀石绿的检测技术主要为液相色谱法、液相色谱-质谱联用法，但传统的分析方法耗时繁琐，需要消耗大量溶剂和样品进行较长时间提取，并需要样品前处理对复杂基质中的痕量孔雀石绿进行富集和净化，以消除基质干扰，这些繁琐复杂的前处理工作会对分析结果带来无法预测的误差。

近年来，环境和生物体中兽药孔雀石绿残留的检测是公认的热点问题之一。高效液相色谱-串联质谱是常规的检测孔雀石绿的方法。然而，该方法繁琐耗时，需要大体积的样品来进行痕量目标物的富集，而且需要多步的前处理手段来消除基体的干扰。另外一个分析难点是孔雀石绿是水溶性的极性化合物，十分难以从极性的复杂基体中分离出来。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种表面修饰分子印迹固相微萃取探针的制备方法。该方法是以孔雀石绿为模板分子，通过将有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液在表面富含羟基的尖状木纤维基质进行热聚合反应，获得表面修饰分子印迹固相微萃取探针。

本发明的另一目的在于提供一种上述方法制备的表面修饰分子印迹固相微萃取探针。

本发明的再一目的在于提供一种上述表面修饰分子印迹固相微萃取探针的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种表面修饰分子印迹固相微萃取探针的制备方法，包括如下具体步骤：

s1.将功能单体和乳化剂混合，在搅拌条件下70～110℃加热，得到分子印迹预乳液；

s2.分子印迹预乳液加入去离子水、碳酸氢钠和引发剂，温度升至70～110℃反应，得到种子乳液；

s3.在种子乳液中滴加硅烷化试剂，反应0.5～1h，得到聚丙烯酸酯乳液；

s4.将聚丙烯酸酯乳液静置后冷却至20～40℃，用氨水调节ph至7～9，再加入孔雀石绿模版分子，制得孔雀石绿有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液；

s5.将干净的木质纤维或竹质纤维在孔雀石绿有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液中浸泡后，在80～120℃热聚合反应20～60min，用洗脱液洗去孔雀石绿模版分子后，得到表面修饰分子印迹固相微萃取探针。

优选地，步骤s1中所述功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、苯乙烯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸丁酯或丙烯酸-2-乙基己酯中的一种以上，所述乳化剂为辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸钠或仲辛基酚聚氧乙烯醚中的一种以上，所述功能单体和乳化剂的质量为(10～50)：1。

优选地，步骤s1中所述搅拌的速率为10000～30000rpm/min。

优选地，步骤s2中所述引发剂为过硫酸钾、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰，所述分子印迹预乳液和去离子水的体积比为(1～3)：1，所述碳酸氢钠和引发剂的质量比为(2～3)：1。

优选地，步骤s2中所述反应的时间为3～5h。

优选地，步骤s4中所述静置的时间为2～3h；步骤s5中所述浸泡的时间为5～20min，所述洗脱液为甲醇和乙酸铵，所述甲醇和乙酸铵的体积比为95：5。

上述方法制备的表面修饰分子印迹的固相微萃取探针。

优选地，包括带有尖端的固体基质和涂层材料，所述的带有尖端的固体基质为木质纤维或竹质纤维；所述木质纤维或竹质纤维的直径在0.1～0.2mm，所述涂层材料为有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液。

上述表面修饰分子印迹固相微萃取探针在萃取痕量的目标物中的应用。

优选地，所述目标物为孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫或隐性结晶紫中的一种以上。

另外，上述表面修饰分子印迹固相微萃取探针在电喷雾电离进行质谱分析中的应用。

固相微萃取(solid-phasemicroextraction,spme)是集采样、萃取、浓缩和进样于一体的前处理技术，其通过物理或化学方法，将具有吸附萃取功能的涂层材料固载在一定的基质表面，与样品进行直接或间接的接触，将目标分析物富集浓缩，然后进行解吸，从而对样品中的目标物进行分析。其具有样品用量小、选择性高等优点。spme涂层材料的性质决定了萃取容量、选择性和灵敏度

原位电离质谱(ambientmassspectrometry,ams)是近年来新兴的一种无需或者只需很少样品前处理步骤，在敞开的常压环境中可直接对物体表面物质进行离子化的质谱分析技术。对于复杂基体中的目标分析物而言，spme与ams联用是一种直接有效的分析手段。将这两种技术联用，能够大大的提高检测灵敏度、降低复杂基体的基体效应，同时又能实现复杂样品的直接、快速的分析。基于此技术的优点，发展一种可直接用于复杂基体痕量化合物固相微萃取和直接电喷雾质谱分析的探针对样品快速检测具有很大的潜力，也具有重要的意义。

本发明的固相微萃取探针在对样品中目标物进行萃取后，可以作为固体基质电喷雾离子源来进行直接电喷雾离子化质谱分析。固相微萃取探针固定在距离质谱入口处5-20mm的支架(例如三维移动平台)，其尖端对准质谱入口，质谱入口端施加高压电场以进行固相微萃取探针解吸/电离质谱分析。该方法整合了固相微萃取和探针电喷雾质谱技术，将固相微萃取探针作为固体基质来诱导电喷雾离子化，实现了痕量孔雀石绿的直接、快速分析。方法学考察结果表明该方法具有良好的线性、重复性和回收率的特点，可有效用于目标物的定量分析。

本发明的固相微萃取探针的涂层材料是以孔雀石绿为模版分子制成的表面分子印迹聚合膜，模版分子被洗脱下来后，印迹位点带有负电荷的羧酸根(-coo^-)，可与孔雀石绿或其结构类似化合物的带有正电荷的伯胺基团进行离子键结合，从而达到与目标物的特异性识别吸附。因此，本发明的固相微萃取探针对孔雀石绿或其结构类似化合物具有很好的吸附性能，使得萃取过程的对目标物具有极强的选择性和富集能力，尤其适合用于带有三苯甲烷和氨基基团的孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫等化合物的分析检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的固相微萃取探针以孔雀石绿为模版分子制成的表面分子印迹聚合膜，模版分子被洗脱下来后，印迹位点带有负电荷的羧酸根(-coo^-)，可与带有三苯甲烷和氨基基团的孔雀石绿或其结构类似化合物中正电荷的伯胺基团进行离子键结合，从而达到与带有三苯甲烷和氨基基团的目标物的特异性识别吸附，可以用于直接检测痕量的孔雀石绿。

2.本发明的方法整合了固相微萃取和探针电喷雾质谱技术，将固相微萃取探针作为固体基质来诱导电喷雾离子化，实现了痕量孔雀石绿的直接、快速分析。该方法具有良好的线性、重复性和回收率的特点，可有效用于目标物的定量分析，尤其适合用于带有三苯甲烷和氨基基团的孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫等化合物的分析检测。

3.本发明的固相微萃取探针对孔雀石绿或其结构类似化合物具有很好的吸附性能，使得萃取过程的对带有三苯甲烷和氨基基团的目标物具有极强的选择性和富集能力，最高可达1854倍，且方法线性关系良好，回收率高，重复性好。

4.本发明可以针对复杂基体中的孔雀石绿进行有效地萃取富集，其富集系数最高可达1800倍，检出限可达0.01μg/l。

附图说明

图1是本发明固相微萃取探针的制备过程。

图2是固相微萃取探针的红外光谱图。

图3是本发明固相微萃取探针电喷雾离子源示意图。

图4是固相微萃取探针的萃取率与溶液体积和萃取时间的关系。

图5是实施例1制备的固相微萃取探针在不同基质中对目标物萃取率对比图。

图6是有模版表面修饰分子印迹固相微萃取探针(mip-tip)与无模版表面修饰分子印迹固相微萃取探针(nip-tip)对目标物(孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫、碱性黄ⅰ和玫红酸)选择性吸附的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

下述实施例中所采用的材料和试剂为：

甲基丙烯酸、丙烯酸、苯乙烯、辛基酚聚氧乙烯醚、丙烯酸羟丙酯、十二烷基硫酸钠、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸丁酯、乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷)、过硫酸钾、碳酸氢钠氨水、甲醇、冰醋酸、去离子水。

标准物质：孔雀石绿(malachitegreen,mg)、隐性孔雀石绿(leucomalachitegreen,lmg)、结晶紫(crystalviolet,cv)、隐性结晶紫(leucocrystalviolet,lcv)、碱性黄ⅰ(thioflavint,tht)、玫红酸(rosolicacid,ra)。内标：孔雀石绿苦味酸盐-d5(mg-d5)。所有标准物质纯度均＞99％。

实施例1固相微萃取探针的制备

1.取24ml去离子水，加入0.1g甲基丙烯酸、0.05g丙烯酸、0.2g苯乙烯、0.2g丙烯酸羟丙酯、1.5g丙烯酸丁酯、1.5g丙烯酸-2-乙基己酯功能单体和0.05g辛基酚聚氧乙烯醚、0.05g十二烷基硫酸钠乳化剂，在乳化机(20000rpm/min)搅拌15min制得预乳液备用。

2.在装有温度计、回流冷凝管、搅拌器的四口烧瓶中加入13ml去离子水、0.1g碳酸氢钠、约7.5g预乳液，在250rpm/min搅拌下升温至80℃，再加入一半的5ml0.11mol/l过硫酸钾引发剂，反应1h后，得到泛蓝光的种子乳液。

3.把搅拌速度降低，在4h内滴加完剩余的预乳液和过硫酸钾溶剂至种子乳液中，得到丙烯酸酯乳液，继续滴加乙烯基三(β-甲氧基乙氧基)硅烷，0.5h后再加入1ml过硫酸钾以消除残余的单体，温度保持2.5h后，再冷却至40℃，通过氨水调节ph至8.5，得到有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液。

4.把木纤维剪成约2cm长度，然后用小刀进一步把木纤维尖端部分削成更为尖细的尖端(外径为0.1～0.2mm，与商品化电喷雾离子源的毛细管尺寸相近)，制作成固相微萃取探针的木纤维基质。

5.晾干后的木质纤维(桦木牙签)放入通入氮气除氧15min的有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液，浸泡10min。取出木质纤维于烘箱以120℃热聚反应20min。

6.反应完成后，木质纤维浸泡于洗脱液(甲醇/乙酸铵的体积比＝95:5)，置恒温振荡器(转速100rpm/min)洗脱48h，其中每24h更换一次洗脱液。洗脱完毕后，木质纤维用去离子水冲洗干净，晾干后即得表面修饰分子印迹固相微萃取探针，如图1所示。

实施例2

1.取24ml去离子水，加入0.3g甲基丙烯酸、0.15g丙烯酸、0.6g苯乙烯、0.6g丙烯酸羟丙酯、4.5g丙烯酸丁酯、4.5g丙烯酸-2-乙基己酯功能单体和0.15g十二烷基硫酸钠和仲辛基酚聚氧乙烯醚乳化剂，在乳化机(10000rpm/min)搅拌15min制得预乳液备用。

2.在装有温度计、回流冷凝管、搅拌器的四口烧瓶中加入13ml去离子水、0.1g碳酸氢钠、约7.5g预乳液，在250rpm/min搅拌下升温至110℃，再加入一半的5ml0.11mol/l偶氮二异丁腈引发剂，反应3h后，得到泛蓝光的种子乳液。

3.把搅拌速度降低，在4h内滴加完剩余的预乳液和过硫酸钾溶剂至种子乳液中，得到丙烯酸酯乳液，继续滴加乙烯基三(β-甲氧基乙氧基)硅烷，反应0.5h后再加入1ml过硫酸钾以消除残余的单体，温度保持2h后，再冷却至40℃，通过氨水调节ph至7，得到有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液。

4.把木纤维剪成约2cm长度，然后用小刀进一步把木纤维尖端部分削成更为尖细的尖端(外径为0.1～0.2mm，与商品化电喷雾离子源的毛细管尺寸相近)，制作成固相微萃取探针的木纤维基质。

5.晾干后的木质纤维放入通入氮气除氧15min的有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液，浸泡10min。取出木质纤维于烘箱以120℃热聚反应20min。

6.反应完成后，木质纤维浸泡于洗脱液(甲醇/乙酸铵的体积比＝95:5)，置恒温振荡器(转速100rpm/min)洗脱48h，其中每24h更换一次洗脱液。洗脱完毕后，木质纤维用去离子水冲洗干净，晾干后即得表面修饰分子印迹固相微萃取探针。

实施例3

1.取24ml去离子水，加入0.51g甲基丙烯酸、0.26g丙烯酸、1g苯乙烯、1g丙烯酸羟丙酯、7.7g丙烯酸丁酯、7.7g丙烯酸-2-乙基己酯功能单体和0.26g辛基酚聚氧乙烯醚、0.26g十二烷基硫酸钠乳化剂，在乳化机(30000rpm/min)搅拌15min制得预乳液备用。

2.在装有温度计、回流冷凝管、搅拌器的四口烧瓶中加入13ml去离子水、0.1g碳酸氢钠、约7.5g预乳液，在250rpm/min搅拌下升温至70℃，再加入一半的5ml0.11mol/l过氧化苯甲酰引发剂，反应5h后，得到泛蓝光的种子乳液。

3.把搅拌速度降低，在4h内滴加完剩余的预乳液和过硫酸钾溶剂至种子乳液中，得到丙烯酸酯乳液，继续滴加乙烯基三(β-甲氧基乙氧基)硅烷，反应1h后再加入1ml过硫酸钾以消除残余的单体，温度保持3h后，再冷却至20℃，通过氨水调节ph至9，得到有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液。

4.把木纤维剪成约2cm长度，然后用小刀进一步把木纤维尖端部分削成更为尖细的尖端(外径为0.1～0.2mm，与商品化电喷雾离子源的毛细管尺寸相近)，制作成固相微萃取探针的木纤维基质。

5.晾干后的竹质纤维放入通入氮气除氧15min的有机硅改性丙烯酸酯分子印迹乳液，浸泡10min。取出竹质纤维于烘箱以80℃热聚反应60min。

6.反应完成后，竹质纤维浸泡于洗脱液(甲醇/乙酸铵的体积比＝95:5)，置恒温振荡器(转速100rpm/min)洗脱48h，其中每24h更换一次洗脱液。洗脱完毕后，竹质纤维用去离子水冲洗干净，晾干后即得表面修饰分子印迹固相微萃取探针。

实施例4固相微萃取探针的表征

图2为固相微萃取探针的红外光谱图。其中，a为无涂层木质纤维的固相微萃取探针，b为无模版表面修饰分子的固相微萃取探针，c为有模版表面修饰分子的固相微萃取探针。从图2中可知，有分子印迹聚合膜涂层的探针比无涂层木质纤维明显多出许多官能团的吸收峰。丙烯酸酯聚合后表露出的－coo^-特异性识别位点增多，使得1734cm^-1c＝o的伸缩振动吸收峰变强。而无模版分子的表面修饰分子印迹固相微萃取探针与有模版分子的表面修饰分子印迹固相微萃取探针的红外谱图的差异主要在3440cm^-1处，有模版分子的表面修饰分子印迹固相微萃取探针在3440cm^-1的吸收峰更强，主要因为有孔雀石绿模版分子的红外吸收。

实施例5萃取及固相微萃取探针电喷雾质谱分析

图3是本发明固相微萃取探针电喷雾离子源示意图。将微萃取探针于含有目标物的基体中进行萃取后，将高压电场加载于微萃取探针，并滴加喷雾溶剂使得目标物解吸并诱导电喷雾的形成，直接于质谱中进行分析。

样品萃取的操作方式与固相微萃取的萃取方式一致，采用直接萃取的模式。萃取后，将固相微萃取探针固定在三维移动台上，使探针尖端对准质谱入口并距离质谱入口约10mm，使用移液枪将10μl的解吸溶剂滴加到探针尖端的表面，解吸的样品溶液在质谱的真空系统作用下形成一股吸力，通过探针表面的分子印迹涂层向探针的尖端移动，在尖端形成泰勒锥，在毛细管端口的高压电场作用下形成带电液滴细的喷雾，液滴在电场和真空系统的作用下，飞向毛细管。在高流量的高温反吹干燥氮气的反向流动，喷雾液滴进一步脱溶剂形成带电荷的气相离子，通过质谱入口进入质量分析器进行分析。

固相微萃取探针电喷雾质谱分析：正离子检测模式，离子传输管温度350℃，锥口电压为65v，八极杆电压为750v，雾化器压力为1psi，干燥器流量为1l/min，串联四极杆质谱分析采用选择高分辨扫描模式，扫描质量范围100～500m/z，离子参数见表1。从表1中可知，在优化毛细管出口电压与毛细管电压的参数后，使mg、lmg、cv、lcv和mg-d5的[m+h]⁺峰的响应信号达到最大，获得最佳的子离子，故选择丰度最高的子离子的电压参数为电离最佳参数。

表1各种化合物的质谱采集参数

注：*标记为实验内标物

实施例6萃取条件研究

在纯净水样品中以50μg/l的添加量加入mg，研究不同萃取条件(溶液体积、萃取时间)对萃取结果的影响，如图4所示。其中，图4(1)为不同溶液体积(5、10、50、100、150、200ml)下的萃取结果。，图4(2)为萃取时间对萃取结果的影响。从图4(1)中可知，增加溶液体积有利于提供更多的目标物，从而提高萃取效率。在低浓度范围内，提高溶液体积明显有利于萃取效率的提升，但当达到一定体积后(100ml)，萃取达到动态平衡，溶液体积进一步的增加无法明显地提升萃取效率。从图4(2)中可知，分析物在样品溶液及固相微萃取探针之间的分布是一个动态平衡，萃取效率随着萃取时间的增加而提升，直到在40min时达到动态平衡。

实施例7萃取能力研究

样品萃取的操作方式与固相微萃取的萃取方式一致，采用直接萃取的模式。

水样(去离子水和河水)：采用蒸馏水或河水各采配制mg、lmg、cv和lcv浓度为50μg/l的混合加标样品，有模版分子的表面修饰分子印迹固相微萃取探针(mip-tip)置于去离子水和河水中400rpm搅拌萃取40min。

牛奶样品：mip-tip加入到牛奶采配制mg、lmg、cv和lcv浓度为50μg/l的混合加标样品中400rpm搅拌萃取60min。

萃取完后，将固相微萃取探针快速从样品中取出，然后放入去离子水中润洗10s后取出，待自然晾干后进行固相微萃取探针电喷雾质谱分析，研究固相微萃取探针的抗干扰萃取能力(图5)。

图5是实施例1制备的固相微萃取探针在不同基质(去离子水、河水和牛奶)中对mg、lmg、cv和lcv萃取率对比图。从图5中可知，固相微萃取探针在江水和牛奶中萃取mg、lmg、cv和lcv的吸附量比在去离子水中的吸附量低，江水和牛奶中含有许多复杂基质，直接影响到目标化合物的吸附效率，但总体来看，即便在食品和环境样品的复杂基体中，mip-tip仍对mg和cv及其代谢产物有较好的选择性吸附。

本发明固相微萃取探针的萃取能力通过研究mip-tip在不同基体中的富集倍数来确定。在水样基体中，500ml(5倍最优量)的样品溶液进行120min(3倍最优时间)的萃取，以模拟原位分析条件。对于牛奶样品，采用优化的实验条件，即，100ml溶液下萃取60min。所获得的富集倍数如表2所示。表2为固相微萃取探针萃取不同基质中mg类化合物的富集倍数。从表2中可知，本发明的固相微萃取探针对于水基体具有非常理想的富集能力。对于纯净水、河水样本，富集倍数值达到约1100-1800倍。不同的水基体对固相微萃取探针的富集能力影响并不明显。

在牛奶样品中，最佳萃取条件下的富集倍数值可达400-550倍。尽管在牛奶样本中，由于基体杂质的干扰，其富集能力远低于水样，然而，如此的富集能力已比现有的方法提高了1个数量级的灵敏度。

表2固相微萃取探针萃取不同基质中mg类化合物的富集倍数

实施例8特异性吸附研究

图6是有模版表面修饰分子印迹固相微萃取探针(mip-tip)与无模版表面修饰分子印迹固相微萃取探针(nip-tip)对样品(mg、lmg、cv、lcv、tht和ra)选择性吸附的结果。其中，图6(1)为孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫、碱性黄ⅰ和玫红酸化学结构式；图6(2)为mip-tip萃取50μg/l孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫、碱性黄ⅰ和玫红酸混合加标去离子水样品分析示意图；图6(3)为nip-tip萃取50μg/l孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫、碱性黄ⅰ和玫红酸混合加标去离子水样品分析示意图。采用的化合物的结构与mg的结构部分相同，如图6(1)所示，研究mip-tip的特异性识别基团与吸附能力。总体而言mip-tip表面的分子印迹涂层对带有氨基基团的化合物有明显的吸附、富集效果，而对三苯类结构的化合物无吸附作用，如图6(2)所示，说明分子印迹涂层的特异性识别位点是通过与化合物的氨基基团识别结合。nip-tip对mg、lmg、cv、lcv、tht有一定的吸附作用，如图6(3)所示，但其富集效果远不足mip-tip的明显，说明mip-tip对孔雀石绿模版分子及其结构类似化合物具有优越的特异性识别吸附能力。

实施例9定量准确性研究

在去离子水中添加浓度范围0.1-100μg/l的mg、lmg、cv和lcv混合标样，研究固相微萃取探针电喷雾质谱分析的定量准确性。表3为固相微萃取探针电喷雾质谱分析孔雀石绿类化合物的线性方程、范围、检出限、重复性和回收率。将mg-d5添加到喷雾溶剂中，作为10μg/l浓度水平下的氘代同位素内标化合物。内标化合物用于分析过程的误差校准，可以大大地提高方法的重复性。结果表明，本发明方法具有良好的线性关系，相关系数(r²)不低于0.9948，如表3所示。最低检出限为0.01–0.05μg/l(由信噪比为3时的峰的浓度确定)。

考察不同探针之间的可重复性实验，以同样的发明方法制备6根不同的固相微萃取探针，该实验结果也显示了良好的重复性，rsds不高于10.8％。回收率试验显示该方法具有良好的准确性，回收率达93.7～99.6％。这些结果显示了本发明的固相微萃取探针电喷雾质谱法可以适用于痕量水平孔雀石绿的直接定量检测。

表3固相微萃取探针电喷雾质谱分析孔雀石绿类化合物的

线性方程、范围、检出限、重复性和回收率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。