一种表面有含外套膜细胞水凝胶层的珍珠核及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种珍珠核及其制作方法，具体的说涉及一种表面覆盖包裹有其中含有贝类动物外套膜表皮细胞的、由生物可降解高分子材料交联形成的水凝胶层的珍珠核及其制备方法。
【背景技术】
[0002]目前有核珍珠的人工培养方法通常都是采用取自供体蚌的外套膜细胞小片与用贝壳制备的珍珠核一起植入育珠蚌的插核部位，然后放入养殖场所中养殖培育珍珠，养殖一段时间后杀蚌取珠。在育珠蚌体内，从外套膜细胞小片游离出来的外表皮细胞会逐渐迀移至珍珠核表面，结缔组织细胞等一些其他类型细胞则围绕在外表皮细胞周围，并与育珠蚌自身的结缔组织之间建立连接，围绕珍珠核形成珍珠囊，外表皮细胞(可能还有一些其他类型细胞)分泌珍珠质形成珍珠。这种方法由于植入时细胞小片只贴于珍珠核的一侧，在细胞迀移过程中，外套膜细胞容易在珍珠核周围分布不均，很多时候细胞小片所在位置的细胞大量堆积，已经开始分泌珍珠质，但珍珠核远离细胞小片的部位细胞尚未迀徙到，因此形成的珍珠囊厚薄不均，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀，圆形珍珠数量少，存在尾巴珠、瑕疵珠等问题，优质珍珠生产率低。如果能使外套膜表皮细胞在珍珠核周围形成基本均匀的分布，则可形成厚薄均匀的珍珠囊，从而大大提高优质圆形珍珠的比例。
[0003]为解决这个问题，“游离细胞植入法培育有核珍珠”(中国发明专利号:200510110378.8)公布了一种通过将游离外套膜细胞与珍珠核共培养，使得外套膜细胞粘附在珍珠核的表面，然后将粘附了外套膜细胞的珍珠核插入育珠蚌的插核部位来培养珍珠的方法。此方法存在以下问题:⑴正常表皮细胞在人工培养的条件下只能贴壁生长成单层，细胞量过少，细胞种类单一。因此该发明通过在插核前后再另外滴入大量细胞液来解决细胞量不足和细胞种类单一的问题。⑵能贴附于珍珠核表面生长的细胞只有表皮上皮细胞，但珍珠囊的形成也需要来自外套膜的结缔组织细胞。⑶球形珍珠核容易滚动，容易因碰撞等导致细胞损伤脱落，在运输、植核等过程中难以保证不损伤细胞等问题。因而至今未能在生产实践上得到应用。
[0004]用胶原蛋白、海藻酸钠、明胶等高分子材料制备的水凝胶支架因含水量高、氧气、营养物质及代谢废物容易运输、液固方便转换、生物相容性好、可降解、制作工艺简单以及易于交联可溶性生长因子等优点而广泛应用于人体组织工程中。本发明利用高分子材料水凝胶的这些性质，将珍珠蚌游离外套膜细胞预混在生物可降解高分子材料的水溶液中，然后使高分子材料在珍珠核表面交联，形成厚度基本均匀的含外套膜细胞的水凝胶层，从而使得外套膜细胞在珍珠核周围形成基本均匀分布，植入到育珠蚌体内后，凝胶支架材料会逐渐降解，外套膜表皮细胞会逐渐迀移到珍珠核表面形成厚度基本均匀的珍珠囊，从而在珍珠核表面均匀分泌珍珠质。本发明解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的外套膜表皮细胞在珍珠核周围分布不均的问题，可以大大提高优质珍珠的比例。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种人工养殖珍珠所使用的珍珠核的处理方法，通过在珍珠核周围包裹一层厚度基本均匀的含珍珠蚌外套膜细胞的水凝胶层，使珍珠蚌的外套膜表皮细胞能基本均匀地分布到珍珠核的周围形成珍珠囊，从而提高优质珍珠的生产效率。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案:
[0007]—、本项目的技术线路:获取外套膜游离细胞一配制高分子材料水凝胶溶液一将外套膜表皮细胞与高分子材料水凝胶溶液混合均匀一将珍珠核放置于模具中，然后将混合液灌注入模具中，使混合液基本均匀分布在珍珠核周围，使高分子材料交联形成含有外套膜表皮细胞的水凝胶层。此即为本发明所说的含有外套膜细胞的水凝胶珍珠核。此外，也可以将珍珠核先与外套膜外表皮细胞共同培养，使珍珠核表面先贴附上单层外套膜外表皮细胞，然后再按上述技术路线将其表面覆盖上含外套膜细胞的水凝胶层。
[0008]二、模具的制作:模具的作用在于使水凝胶层厚度基本均匀，从而使外套膜细胞能在珍珠核周围形成较为均匀的分布，可以采取以下2种方法。
[0009]1.方法一:采用二次成型的方法。模具由模具I和模具II组成，模具I由两个结构一样的中空半球构成，使用时将2个半球合拢即成为一个完整的中空球体；以球体的注胶孔所处位置为南极，其对侧为北极，每个半球的内侧面有3条南北极方向排列的条状突起(以下简称棱)，其中的2条棱分别位于半球的两侧边缘，另一条棱位于半球中间，优选的是位于半球的正中间位置，3条棱的末端在球的南北极处相交，在南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔；棱宽度不限，优选的是中间棱宽2?3mm左右，棱高度在0.02?2mm之间，优选的是0.8?1.2mm左右，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核外的空间高度(即将来水凝胶支架厚度)一致，其高度就是水凝胶层的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球合拢成一个球体，棱的一端球面是封闭的，另一端(即切除了部分棱的南极端)球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注水凝胶溶液，此端对接处的棱被切除了部分，留出孔道使高分子材料水凝胶溶液能同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中。模具I用于完成珍珠核水凝胶层制备的第一步，得到表面有4道凹槽的水凝胶层珍珠核。模具II由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起，半球的内径长度为模具I棱高度的2倍与珍珠核直径之和，两半球合拢后一端留有一个注胶孔用于灌注高分子材料水凝胶溶液，模具II用来完成珍珠核外水凝胶层凹槽的填补，最后得到凝胶层厚度基本一致的球形水凝胶珍珠核。
[0010]2.方法二:采用一次成型的方法。模具由两个中空的半球构成，每个半球的内侧面有3根与半球平面垂直的细柱，彼此相隔120°，细柱的作用在于支撑珍珠核，目的在于使珍珠核周围的空间高度一样，从而使水凝胶层厚度均匀，与半球的平面垂直是便于凝胶以后脱模时不损伤水凝胶。细柱的长度在0.02?2_左右，优选的是0.8?1.2_。两半球合拢后一端球面留有一小孔用于灌注水凝胶溶液。当灌入的高分子材料和细胞凝结成凝胶后脱模。凝胶中会留下支撑柱造成的小孔，但由于凝胶在蚌体内会逐渐降解，细胞也会自动迀移粘附到珍珠核表面，这些小孔不会影响将来植核后外套膜表皮细胞在珍珠核周围的均匀分布。
[0011]三、外套膜表皮游离细胞的获取方法:清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1_2小块，采用酶消化法消化组织块，通常采用0.25wt%的胰酶，在25?37°C范围内消化0.5?4小时，用200目絹网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，使细胞悬液密度在1 X 105?5 X 107个细胞/mL之间，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞悬液，放置于冰浴状态下。由于珍珠质是由外套膜外表皮细胞分泌形成的，外套膜内表皮细胞不参与珍珠囊的形成，因此也可以在洗涤消毒后先刮去外套膜的内表皮，再酶解消化组织块，得到主要由外表皮细胞和结缔组织细胞组成的游离细胞悬液。得到的细胞悬液可进一步在体外培养增殖后使用；也可进一步在细胞中导入外源基因如SV40病毒、EB病毒、端粒酶基因等使外表皮细胞成为永生化细胞，经体外培养扩增后使用，以节约提供外套膜的珍珠贝资源。
[0012]四、采用的水凝胶高分子材料:可以作为本发明使用的高分子水凝胶的材料有天然的生物可降解高分子材料和人工合成的生物可降解高分子材料，天然可降解高分子材料可选择胶原蛋白、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等以及它们之间及它们与其他材料形成的复合物，人工合成生物可降解高分子材料可选择聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)等以及它们之间及它们与其他材料形成的复合物。其中优选的是胶原蛋白。胶原蛋白是普遍存在于动物结缔组织中的一类纤维蛋