引物组合物及其应用、阴道毛滴虫检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医学生物技术领域，且特别涉及一种引物组合物及其应用、阴道毛滴虫检测试剂盒。

背景技术：

阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis,t.vaginalis)是一种常见的寄生原虫，呈全球分布，以性传播为主，也可以通过间接接触传播。其常寄生于女性阴道和尿道，男性的尿道和前列腺，表现为无症状带虫状态或急、慢性炎症。阴道毛滴虫作为细胞外寄生原虫主要是吸附在上皮细胞表面寄生，其对上皮细胞的损伤主要依赖于直接接触。虫体感染人的生殖泌尿道后，其多形性伪足穿行与包绕及鞭毛运动的机械作用，尤其是释放水解酶的消化作用和吞噬作用以及细胞脱落因子等综合因素，可直接损伤寄生部位的上皮细胞，继而引起组织器官炎症。

据统计，全世界每年有超过1.7亿人感染此病，各地人群的感染率有所不同且有增高趋势。美国每年有将近500万人感染阴道毛滴虫；日本妇女阴道毛滴虫感染率为24.3％；乌干达农村妇女感染率为23.8％；南非农村妇女感染率为18.0％；而在我国，不同地方及不同人群中阴道毛滴虫的感染率波动很大，范围在百分之几到百分之几十之间。阴道毛滴虫感染可造成妇女非典型性盆腔炎，男性的尿道炎、前列腺炎，其还可引起新生儿滴虫性肺炎、支气管炎和口腔损害等呼吸道炎症。孕妇感染可出现胎膜早破、早产、流产和新生儿体重过低。近年研究显示，阴道毛滴虫感染还与女性的宫颈癌、男性的前列腺癌以及不孕不育有关，此外，阴道毛滴虫的广泛感染和流行还增加了人类感染免疫缺陷病毒(hiv)和支原体的风险。研究表明，阴道毛滴虫已经成为hiv感染的重要协同因素。

准确诊断阴道毛滴虫的感染是防治该病的重要环节，对阻止该病传播具有重要的意义。目前，阴道毛滴虫的检测方法主要有湿片法、培养法、pcr、荧光抗体法和elisa。其中湿片法费用低，但敏感性差；培养法是被公认的诊断滴虫病的“金标准”，其敏感性较高，但费时长，且要求标本质量高以及镜检者具有很好的专业知识和经验；pcr检测敏感性强、特异性高，但其依赖于价格昂贵的pcr仪，且扩增产物需要进行凝胶电泳进行分析；荧光抗体法和elisa敏感性强，但特异性较差，且抗体花费高，检测耗时长。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种引物组合物，该引物组合物能够有效用于扩增阴道毛滴虫的靶向dna。

本发明的第二目的在于提供一种上述引物组合物在制备阴道毛滴虫检测试剂盒中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种阴道毛滴虫检测试剂盒，该试剂盒成本较低，可用于诊断是否感染阴道毛滴虫，具有较高的敏感性和特异性。

本发明的第四目的在于提供一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种引物组合物，由4条引物组成，4条引物分别为f3、b3、fip和bip，f3、b3、fip和bip的碱基序列分别如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

本发明还提出上述引物组合物在制备阴道毛滴虫检测试剂盒中的应用。

本发明还提出一种阴道毛滴虫检测试剂盒，其包括上述引物组合物。

本发明还提出一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。

本发明较佳实施例提供的引物组合物及其应用、阴道毛滴虫检测试剂盒的有益效果是：

引物组合物能够有效用于扩增阴道毛滴虫的靶向dna，该引物组合物可应用于制备阴道毛滴虫检测试剂盒，并可应用于检测阴道毛滴虫。

本发明较佳实施例中的阴道毛滴虫检测试剂盒成本较低，可用于诊断是否感染阴道毛滴虫，具有较高的敏感性和特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的阴道毛滴虫actin基因的巢式pcr的扩增步骤中的阴道毛滴虫actin基因巢式pcr扩增产物图；

图2为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因的lamp扩增步骤中的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物电泳图；

图3为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因的lamp扩增步骤中的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物显色图；

图4为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中的阴道毛滴虫actin基因巢式pcr外套扩增产物电泳图；

图5为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中的阴道毛滴虫actin基因巢式pcr内套扩增产物电泳图；

图6为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物电泳图；

图7为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物显色图；

图8为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中第(4)步的阴道毛滴虫actin基因巢式pcr外套扩增产物电泳图；

图9为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中第(4)步的阴道毛滴虫actin基因巢式pcr内套扩增产物电泳图；

图10为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中第(4)步的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物电泳图；

图11为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性步骤中第(4)步的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物显色图；

图12为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的特异性步骤中的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物电泳图；

图13为本发明提供的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的特异性步骤中的阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增产物显色图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例进行具体说明。

本发明实施例提供的引物组合物为阴道毛滴虫黏附蛋白65(ap65)基因的特异性引物。该引物组合物由4条引物组成，4条引物分别为f3、b3、fip和bip。具体地，f3、b3、fip和bip的碱基序列分别如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

seqidno.5：cctgccagaagtgggcta；seqidno.6：acctgaccgatgagtgtgta；seqidno.7：cgtgggtagttgcggaggatgacaccgccagtcataccg；seqidno.8：tcgtcgttacagatggtggccagcttgccgactgggata。

上述4条(f3、b3、fip和bip4)引物是以阴道毛滴虫黏附蛋白65(adhesionprotein65，ap65)基因作为靶标分子而设计的，因此，该4条引物对阴道毛滴虫具有较高的特异性和敏感性。

作为可选地，可将上述引物组合物用于制备阴道毛滴虫检测试剂盒，以快速、准确的检测是否感染阴道毛滴虫。

进一步地，本发明实施例还提供了阴道毛滴虫检测试剂盒，其包括上述引物组合物，也即包括f3、b3、fip和bip。

作为可选地，该阴道毛滴虫检测试剂盒还可包括dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液以及超纯水。其中，甜菜碱可促进dna双链的解链，并减少引物二聚体的产生。氯化镁所含的镁离子为polymerase的激活剂，其浓度过高会降低扩增的特异性，浓度过低会影响扩增产量，甚至导致扩增失败得不到所需的扩增产物。

鉴于此，本实施例中阴道毛滴虫检测试剂盒中所含的引物组合物及各试剂的浓度分别可以如下：f3的浓度为3.5-4.5μmol/l、b3的浓度为3.5-4.5μmol/l、fip的浓度为15-17μmol/l、bip的浓度为15-17μmol/l；dntps的浓度为8-12μmol/l、甜菜碱的浓度为4.5-5.5μmol/l、氯化镁的浓度为23-27mmol/l、bstdna聚合酶的浓度为7.5-8.5u/μl。bstdna聚合酶缓冲液优选为10倍浓度，也即10×bstdna聚合酶缓冲液。

更佳地，上述阴道毛滴虫检测试剂盒中所含引物组合物及各试剂的浓度分别如下：f3的浓度为4μmol/l、b3的浓度为4μmol/l、fip的浓度为16μmol/l、bip的浓度为16μmol/l；dntps的浓度为10μmol/l、甜菜碱的浓度为5μmol/l、氯化镁的浓度为25mmol/l、bstdna聚合酶的浓度为8u/μl。bstdna聚合酶缓冲液为10倍浓度。

进一步地，上述阴道毛滴虫检测试剂盒还可包括染料，作为可选地，本实施例中的染料例如可以为sybrgreenⅰ、goldview和eb中的任意一种。

优选地，本实施例中的染料选用sybrgreenⅰ。该染料配合试剂盒中的其它试剂和引物组合物，对阴道滴毛虫的检测具有显著的敏感性，不需要紫外激发即可使扩增产物显色。而经goldview和eb两种染料染色后的扩增产物需在紫外激发条件下才能显色。因此，sybrgreenⅰ较其余两种染料使用更加方便，效果也较佳。

在具体检测过程中，可将经sybrgreenⅰ染色后的阴道毛滴虫的dna扩增产物在日光或紫外光的环境中显色。其显色情况如下：在日光环境中显示绿色荧光，在紫外光的环境中显示强烈的荧光。

此外，本实施例还提供一种上述引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。较佳地，本应用采用的为lamp技术，包括提取待测样品的dna，用上述阴道毛滴虫检测试剂盒对样品的dna进行lamp扩增，然后检测扩增产物。

作为可选地，lamp扩增过程中的反应体系由本实施例上述阴道毛滴虫检测试剂盒中所含引物组合物及各试剂组成。

与上述引物组合物及各试剂的较佳浓度对应地，引物组合物及各试剂的体积例如可以如下：f3的体积为0.5-1.5μl、b3的体积为0.5-1.5μl、fip的体积为0.5-1.5μl、bip的体积为0.5-1.5μl；dntps的体积为1.5-2.5μl、甜菜碱的体积为5.5-6.5μl、氯化镁的体积为2.5-3.5μl、bstdna聚合酶的体积为1-2μl、bstdna聚合酶缓冲液的体积为1.5-2.5μl。另外，反应体系中的超纯水的体积可以为0.5μl，dna的体积可以为0.8-1.2μl。

与上述引物组合物及各试剂的更佳浓度对应地，引物组合物及各试剂的体积例如可以如下：f3的体积为1μl、b3的体积为1μl、fip的体积为1μl、bip的体积为1μl；dntps的体积为2μl、甜菜碱的体积为6μl、氯化镁的体积为3μl、bstdna聚合酶的体积为1.5μl、bstdna聚合酶缓冲液的体积为2μl、dna的体积为1μl、超纯水的体积为0.5μl。

较佳地，本实施例中反应体系所含的f3、b3、fip、bip、dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液、dna以及超纯水的总体积控制在20μl。

进一步地，本实施例中lamp扩增可以包括以下步骤：混合f3、b3、fip、bip、dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液、dna以及超纯水，得到混合物。

将上述混合物于60-70℃的条件下第一次孵育110-130min，然后再于至少80℃的条件下灭活bstdna聚合酶得到扩增产物。可选地，灭活bstdna聚合酶可以是将第一次孵育后的混物于至少80℃的条件下第二次孵育8-12min，以保证bstdna聚合酶完全被灭活。

作为可选地，第一次孵育和第二次孵育均采用恒温水浴方式进行。较优地，第一次孵育可以在63℃的条件下恒温水浴120min，第二次孵育可以在80℃的条件下恒温水浴10min。

当阴道毛滴虫检测试剂盒中不含有染料时，可以通过核酸凝胶电泳的方法对扩增产物进行检测。由此得到的检测结果若显示阶梯状扩增条带，则表示该检测样品阴道毛滴虫呈阳性；若检测结果未显示阶梯状扩增条带，则表示该检测样品阴道毛滴虫呈阴性。

当阴道毛滴虫检测试剂盒中含有荧光染料时，对扩增产物的检测即可于扩增产物中加入荧光染料，然后在日光或紫外光环境中观察扩增产物的荧光显色情况。当荧光染料是goldview和eb时，扩增产物需在紫外激发条件下观察显色情况；而当荧光染料是sybrgreenⅰ时，扩增产物在日光灯下即可观察到显色情况。加入染料后得到的检测结果若在日光下显示绿色荧光或在紫外光下显示强烈的荧光，则表示该检测样品阴道毛滴虫呈阳性；若在日光或在紫外光下未显示绿色荧光而呈橙色，则表示该检测样品阴道毛滴虫呈阴性。

值得说明的是，本实施例中的染料并非仅限于上述染料，其它任何可以使dna扩增产物显色以判断检测样品是否感染阴道毛滴虫的染料均在本方案的保护范围之内。此外，上述阴道毛滴虫检测试剂盒所包括的试剂及lamp扩增方法中的步骤和参数均可根据实际情况做适当调整。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种引物组合物，其由f3、b3、fip和bip四条引物组成。f3、b3、fip和bip以阴道毛滴虫黏附蛋白65(adhesionprotein65，ap65)基因作为靶标分子设计而得，该四条引物的碱基序列分别如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

实施例2

本实施例提供一种阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒包括实施例1中的引物组合物以及dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液和超纯水。

实施例3

本实施例提供一种阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒包括实施例1中的引物组合物以及dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液和超纯水。

其中，f3的浓度为3.5μmol/l、b3的浓度为3.5μmol/l、fip的浓度为15μmol/l、bip的浓度为15μmol/l；dntps的浓度为8μmol/l、甜菜碱的浓度为4.5μmol/l、氯化镁的浓度为23mmol/l、bstdna聚合酶的浓度为7.5u/μl、bstdna聚合酶缓冲液为10×bstdna聚合酶缓冲液。

实施例4

本实施例提供一种阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒包括实施例1中的引物组合物以及dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液和超纯水。

其中，f3的浓度为4.5μmol/l、b3的浓度为4.5μmol/l、fip的浓度为17μmol/l、bip的浓度为17μmol/l；dntps的浓度为12μmol/l、甜菜碱的浓度为5.5μmol/l、氯化镁的浓度为27mmol/l、bstdna聚合酶的浓度为8.5u/μl、bstdna聚合酶缓冲液为10×bstdna聚合酶缓冲液。

实施例5

本实施例提供一种阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒包括实施例1中的引物组合物以及dntps、甜菜碱、氯化镁、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶缓冲液和超纯水。

其中，f3的浓度为4μmol/l、b3的浓度为4μmol/l、fip的浓度为16μmol/l、bip的浓度为16μmol/l；dntps的浓度为10μmol/l、甜菜碱的浓度为5μmol/l、氯化镁的浓度为25mmol/l、bstdna聚合酶的浓度为8u/μl、bstdna聚合酶缓冲液为10×bstdna聚合酶缓冲液。

实施例6

本实施例提供一种包括sybrgreenⅰ染料的阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒中除sybrgreenⅰ染料外所含的物质可以与实施例3-5中任一实施例相同。

实施例7

本实施例提供一种包括goldview染料的阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒中除goldview染料外所含的物质可以与实施例3-5中任一实施例相同。

实施例8

本实施例提供一种包括eb染料的阴道毛滴虫检测试剂盒。该试剂盒中除eb染料外所含的物质可以与实施例3-5中任一实施例相同。

实施例9

本实施例提供一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。包括提取待测样品的dna，并按以下体系配制成混合物：

1.5μl浓度为4.5μmol/l的f3、1.5μl浓度为4.5μmol/l的b3、1.5μl浓度为17μmol/l的fip、1.5μl浓度为17μmol/l的bip、2.5μl浓度为12μmol/l的dntps、6.5μl浓度为5.5μmol/l的甜菜碱、3.5μl浓度为27mmol/l的氯化镁、2μl浓度为8.5u/μl的bstdna聚合酶、2.5μl的10×bstdna聚合酶缓冲液、0.5μl的超纯水以及1.2μl的dna。

将上述混合物于60℃恒温水浴下第一次孵育130min，然后再于80℃恒温水浴下第二次孵育12min以灭活bstdna聚合酶，得到扩增产物。以核酸凝胶电泳的方式对扩增产物进行检测。

实施例10

本实施例提供一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。包括提取待测样品的dna，并按以下体系配制成混合物：

0.5μl浓度为3.5μmol/l的f3、0.5μl浓度为3.5μmol/l的b3、0.5μl浓度为3.5μmol/l的fip、0.5μl浓度为3.5μmol/l的bip、1.5μl浓度为8μmol/l的dntps、5.5μl浓度为4.5μmol/l的甜菜碱、2.5μl浓度为23mmol/l的氯化镁、1μl浓度为7.5u/μl的bstdna聚合酶、1.5μl的10×bstdna聚合酶缓冲液、0.5μl的超纯水以及0.8μl的dna。

将上述混合物于70℃恒温水浴下第一次孵育110min，然后再于85℃恒温水浴下第二次孵育8min以灭活bstdna聚合酶，得到扩增产物。

于扩增产物中加入goldview，然后于紫外激发的条件下观察扩增产物的显色情况。

实施例11

本实施例提供一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。包括提取待测样品的dna，并按以下体系配制成混合物：

1μl浓度为4μmol/l的f3、1μl浓度为4μmol/l的b3、1μl浓度为4μmol/l的fip、1μl浓度为4μmol/l的bip、2μl浓度为10μmol/l的dntps、6μl浓度为5μmol/l的甜菜碱、3μl浓度为25mmol/l的氯化镁、1.5μl浓度为8u/μl的bstdna聚合酶、2μl的10×bstdna聚合酶缓冲液、0.5μl的超纯水以及1μl的dna。

将上述混合物于63℃恒温水浴下第一次孵育120min，然后再于80℃恒温水浴下第二次孵育10min以灭活bstdna聚合酶，得到扩增产物。

于扩增产物中加入sybrgreenⅰ，然后于日光下观察扩增产物的显色情况。

实施例12

本实施例提供一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。其与实施例11的区别在于：于扩增产物中加入sybrgreenⅰ，然后于紫外光的条件下观察扩增产物的显色情况。

实施例13

本实施例提供一种引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用。其与实施例11的区别在于：于扩增产物中加入eb，然后于紫外激发的条件下观察扩增产物的显色情况。

试验例

基础材料：阴道毛滴虫：阴道毛滴虫新乡株(trichomonasvaginalisxinxiangstrain)，取自滴虫性阴道炎患者的阴道分泌物，由新乡医学院分离、培养及保存。lamp引物：f3、b3、fip和bip四条引物由在线网站设计、生成，其序列分别如seqidno.5至seqidno.8所示。巢式pcr引物：外、内套引物分别如seqidno.1-seqidno.4所示。

seqidno.1：tctggaatggctgaagaagacg；seqidno.2：cagggtacatcgtattggtc；seqidno.3：cagacactcgttatcg；seqidno.4：cggtgaacgatggatg。

试剂与工具酶：dna提取试剂盒购买于omega公司，dna分子量标准物、mgcl2和dntps购买于大连宝生物有限公司(takara)，甜菜碱、sybrgreeni和bstdna聚合酶(10×bstdnabuffer)购买于索莱宝生物科技有限公司，2×pcrmastermix购买于南京翼飞雪生物公司，其他试剂为国产分析纯。

仪器设备：紫外可见分光光度计(bio-rad)；电热恒温水槽(型号：dk-8d，上海森信实验仪器有限公司)，离心机(eppendorfcentrifuge5810r)、pcr仪(eppendorf)、电泳仪(型号：dyy-11b北京六一仪器)，核酸凝胶成像系统(bio-rad)。

操作如下：

1.阴道毛滴虫的收集

将阴道毛滴虫无菌接种于肝浸汤培养液中(每毫升培养液含青霉素1000u，链霉素1mg，制霉菌素1000u)，37℃培养48h。培养好的虫体于2000r/min的条件下离心5min，pbs清洗两次。

2.阴道毛滴虫dna的提取

将收集的阴道毛滴虫按照omegadna提取试剂盒的说明书所述，进行阴道毛滴虫总dna提取。提取好的dna于-20℃的条件下冻存备用。该dna的初始浓度为90ng/μl。

3.阴道毛滴虫actin基因的巢式pcr的扩增

(1)以上述阴道毛滴虫dna为模板进行巢式pcr。反应所需要的外、内套引物out-f、out-r、in-f、in-r序列分别如seqidno.1-seqidno.4所示。

(2)外套pcr反应体系如下所述配制：

混匀后离心，外套pcr反应条件如下所述：

预变性：95℃，3min；变性：95℃，45s；退火：55℃，30s；第一次延伸：72℃，1min；第二次延伸：72℃，10min；保存：4℃。其中，变性、退火和第一次延伸为35个循环。

(3)内套pcr反应体系如下述配制：

混匀后瞬时离心，内套pcr反应条件如下所述：

预变性：95℃，5min；变性：95℃，45s；退火：50℃，30s；第一次延伸：72℃，1min；第二次延伸：72℃，10min；保存：4℃。其中，变性、退火和第一次延伸为35个循环。

(4)外、内套pcr结束之后，分别取10μl产物进行1％的核酸凝胶电泳。如图1所示，可见一条1100bp大小的dna片段。图1中m代表dna标准分子(marker)；1代表阴性对照外套扩增产物；2代表阴性对照内套扩增产物；3代表阴道毛滴虫dna外套扩增产物；4代表阴道毛滴虫dna内套扩增产物。

(5)内套pcr产物经回收、纯化后进行测序，结果表明该序列与已知的阴道毛滴虫actin基因序列的同源性可达99％。

4.阴道毛滴虫ap65基因的lamp扩增

(1)以上述提取的阴道毛滴虫的dna为模板，按照下表所述配制lamp反应体系。

(2)将该反应体系充分混匀，离心，放置于63℃恒温水浴锅孵育120分钟。

(3)将上述反应体系转入80℃恒温水浴锅孵育10分钟，灭活bstdna聚合酶。

(4)反应结束后取5μl反应产物进行核酸凝胶电泳，如果结果显示阶梯状扩增条带(图2)则表示该检测样品阴道毛滴虫阳性，否则为阴性；或者向剩余的15μl反应中加入2μl的sybrgreeni，如果在日常光下显示绿色荧光或者在紫外光下显示强烈的荧光(图3)，则表示该检测样品阴道毛滴虫阳性，否则为阴性。

图2中m代表dna标准分子(marker)；1代表阴性对照lamp扩增产物；2代表阴道毛滴虫dnalamp扩增产物。图3中1代表阴性对照lamp扩增产物(橙色)；2代表阴道毛滴虫dnalamp扩增产物(绿色)。

5.阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的敏感性

(1)将上述提取的初始浓度为90ng/μl的阴道毛滴虫的模板dna进行10¹-10¹²倍比稀释，备用。

(2)按照上述操作过程分别进行巢式pcr和lamp扩增。

(3)结果如图4-图7所示，巢式pcr扩增能够检测到的最低模板浓度为90×10^-7ng/μl(图4和图5)，而lamp扩增技术能够检测到的最低模板浓度为90×10^-10ng/μl(图6和图7)。

图4中m代表dna标准分子(marker)；1-8分别为阴道毛滴虫dna进行10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释。图5中m代表dna标准分子(marker)；1-8分别为阴道毛滴虫dna进行10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释后，经外套pcr扩增，然后再以外套扩增产物进行巢式pcr内套扩增。图6中m代表dna标准分子(marker)；1-7分别为阴道毛滴虫dna进行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²倍稀释。图7中1-7分别为阴道毛滴虫dna进行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²倍稀释，1-5显绿色，6、7显橙色。

由此说明：本发明中基于lamp所建立的阴道毛滴虫检测技术的敏感性是巢式pcr的1000倍。

(4)为了进一步探讨该lamp扩增技术在阴道毛滴虫检测中的敏感性，将阴道毛滴虫滋养体分别稀释到10³、10²、10¹、0个，并分别进行dna的提取，按照上述操作过程分别进行巢式pcr和lamp扩增。结果如图8-图11所示，巢式pcr可以检测到10³个阴道毛滴虫滋养体(图8和图9)，而lamp扩增可以检测到10个阴道毛滴虫滋养体(图10和图11)。

图8中m代表dna标准分子(marker)；1-4分别为10³、10²、10¹、0个阴道毛滴虫滋养体。图9中m代表dna标准分子(marker)；1-4分别为10³、10²、10¹、0个阴道毛滴虫滋养体dna，经外套pcr扩增，然后再以外套扩增产物进行巢式pcr内套扩增。图10中m代表dna标准分子(marker)；1-4分别为10³、10²、10¹、0个阴道毛滴虫滋养体。图11中1-4分别为10³、10²、10¹、0个阴道毛滴虫滋养体。1-3显示绿色，4显示橙色。

6.阴道毛滴虫ap65基因lamp扩增的特异性

(1)分别以阴道毛滴虫、旋毛虫、弓形虫、大肠杆菌、白色念珠菌、人型支原体、金黄色葡萄球菌等病原体的dna为模板，按照上述阴道毛滴虫ap65基因的lamp扩增过程进行检测。

(2)结果如图12和图13所示，只有阴道毛滴虫样品为阳性扩增，表明该阴道毛滴虫的lamp检测技术具有较好的特异性。

图12中m代表dna标准分子(marker)；1-7分别是阴道毛滴虫、旋毛虫、弓形虫、大肠杆菌、白色念珠菌、人型支原体、金黄色葡萄球菌等病原体的dna。图13中1-7分别是阴道毛滴虫、旋毛虫、弓形虫、大肠杆菌、白色念珠菌、人型支原体、金黄色葡萄球菌等病原体的dna。图13中1显示绿色，2-7显示橙色。

综上所述，本发明方案中所提出的引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用和其所对应的引物组合物具有高特异性、高敏感性等优点。使用该引物组合物检测阴道毛滴虫、旋毛虫、弓形虫、大肠杆菌、白色念珠菌、人型支原体、金黄色葡萄球菌等病原体，结果只从阴道毛滴虫样品中得到阳性扩增。应用所得的结果是巢式pcr检测技术的1000倍，10个阴道毛滴虫滋养体也能检测出来。并且，上述引物组合物在检测阴道毛滴虫中的应用不需要特殊仪器，所用试剂廉价，所耗时间较短且操作简便。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

sequencelisting

<110>新乡医学院

<120>引物组合物及其应用、阴道毛滴虫检测试剂盒

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tctggaatggctgaagaagacg22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cagggtacatcgtattggtc20

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cagacactcgttatcg16

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cggtgaacgatggatg16

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cctgccagaagtgggcta18

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

acctgaccgatgagtgtgta20

<210>7

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgtgggtagttgcggaggatgacaccgccagtcataccg39

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tcgtcgttacagatggtggccagcttgccgactgggata39