检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法与流程

本发明涉及病毒基因突变检测技术领域，具体涉及检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法。

背景技术：

HCMV属于疱疹病毒科 ,β疱疹病毒亚科, 巨细胞病毒属, 人疱疹病毒 5 型。HCMV 基因组为线性双股 DNA 分子 , 长约 230 kb ,由长单一序列( UL)和短单一序列(US) 构成。HCMV 在自然界广泛存在,正常人群中自然感染普遍。

人巨细胞病毒（HCMV）是一种免疫缺陷或免疫不成熟人群的条件致病菌，大多数感染者无明显症状,但在先天感染的儿童中，或免疫功能受抑制的个体，如器官移植者，获得性免疫缺陷病综合征（艾滋病）患者中，容易激活感染，引发严重病变，危及生命。此外，巨细胞病毒宫内感染还是导致出生缺陷的主要原因之一。因此，巨细胞病毒的药物干预和治疗显得尤为重要。

治疗HCMV感染的抗病毒药物为更昔洛韦（GCV），西多福韦（CDV）和膦甲酸（PFA）。巨细胞病毒耐药突变主要是由于UL97和UL54基因发生突变导致。UL97 基因全长 2124 个碱基 ,编码一种蛋白激酶相关的磷酸转移酶，含有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶功能域。HCMV感染细胞内的磷酸化过程是UL97基因编码的产物所完成。GCV是第一个被开发及应用最普遍的治疗 HCMV 感染的高效药物, 必须在此酶作用下发生单磷酸化进一步三磷酸化发挥抗病毒作用, 因此，UL97基因的突变导致GCV不能发生磷酸化而获得活性,导致GCV耐药性的出现。GCV是目前预防和治疗 HCMV病的一线药物，长期治疗后，GCV首先可发生UL97突变，因此 UL97通常是临床检测耐药基因突变的首选基因。GCV耐药突变主要集中在460、520、590至607位点（图1），如M460V/I, H520Q, C592G, A594V, L595S和C603W出现在80%以上以GCV为首选药物的病人体内。UL54 基因全长3729个碱基, 编码由1242个氨基酸组成的 DNA 聚合酶。与UL97基因突变只能导致更昔洛韦（GCV）耐药不同，因为三种药物都是针对编码病毒DNA聚合酶的UL54基因的，因此该基因的突变可以导致这三种药物耐药。与UL97基因耐药位点较为集中不同，UL54基因突变位点更多，其耐药检测只能通过测序，至少需覆盖氨基酸300-1000位点（图1）。抗HCMV药物耐药是免疫功能缺陷患者的一个严重的问题， UL54和UL97基因突变引起的多药物耐药对于异源干细胞移植病人可危及生命。

目前，传统基因突变诊断方法包括限制性片段长度多态性分析（RFLP），基因芯片法，荧光定量PCR等，这些方法存在耗时费力或所需设备和耗材昂贵等缺点，导致不能在临床大规模推广，应用受到限制。同时，巨细胞病毒（HCMV）UL54和UL97基因耐药突变位点众多，上述方法根本无法全部涵盖这些位点。因此有必要建立一种高效率、使用方便的巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的方法，以实现临床快速检测和大规模人群筛查。用本专利申请的巢式PCR的方法进行检测可以完全覆盖所有的突变位点，且不需要贵重的专用仪器，对技术人员要求不高，只需要PCR实验室常规的设备即可，适用于在国内医院推广使用。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因。

本发明的另一目的在于提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，该巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性，所得到的PCR产物可直接送去测序，根据序列即可分析巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变情况。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物（图2）：

当检测巨细胞病毒UL54时，

第一轮PCR扩增引物为：

第一对引物：正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1；

第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物：

第二对引物：正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2；

第三对引物：正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3；

当检测巨细胞病毒UL97时，

所述第一轮PCR扩增引物为：

第四对引物：正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1；

所述第二轮PCR扩增引物为：

第五对引物：正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2；

其中，UL54-SF1基因序列如SEQ ID No.1 所示，UL54-SR1基因序列如SEQ ID No.2所示，UL54-SF2基因序列如SEQ ID No.3 所示，UL54-SR2如SEQ ID No.4 所示，UL54-SF3基因序列如SEQ ID No.5所示，UL54-SR3如SEQ ID No.6 所示，UL97-SF1如 SEQ ID No.7 所示，UL97-SF1如 SEQ ID No.8 所示，UL97-SF2如SEQ ID No.9 所示，UL97-SR2如SEQ ID No.10 所示。

本发明提供的用于检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的引物，第一到第三对引物用来扩增UL54基因，第四到第五对引物用来扩增UL97基因。第一对引物中的正向引物（即上游引物）UL54-SF1选择巨细胞病毒UL54基因nt731-747保守区域；反向引物(即下游引物)UL54-SR1主要部分选择nt3223- 3239保守区域。第一对引物将扩增出2509bp大小的片段。第二对引物中的正向引物UL54-SF2选择巨细胞病毒UL54基因nt779-796位保守区域；反向引物UL54-SR2选择nt1924-1940位保守区域。第二对引物将扩增出1162bp大小的片段。第三对引物中的正向引物UL54-SF3选择巨细胞病毒UL54基因nt1795- 1818位保守区域；反向引物UL54-SR3选择nt3033-3048位保守区域。第三对引物将扩增出1254bp大小的片段。第四对引物中的正向引物UL97-SF1选择巨细胞病毒UL97基因nt821-842位保守区域，第四对引物中的反向引物UL97-SR1选择巨细胞病毒UL97基因nt1953-1972位保守区域，第四对引物将扩增出1152bp大小的片段。第五对引物中的正向引物UL97-SF2选择巨细胞病毒UL97基因nt868-886位保守区域，第五对引物中的反向引物UL97-SR2选择巨细胞病毒UL97基因nt1914-1933位保守区域，第五对引物将扩增出1066bp大小的片段。

本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，其包括如下步骤：

（1）以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50-150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；

（2）以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；

（3）对第二轮PCR产物进行检测。

优选地，所述步骤（1）中，待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。

优选地，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为10-25μL。

优选地，所述步骤（1）中，第一轮 PCR 的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1-2μL，双蒸水补齐至25μL。

优选地，所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸2min30s，共34个循环；3）、68℃后延伸5min。

优选地，所述步骤（2）中，第二轮PCR反应体系的体积为25-50μL。

优选地，所述步骤（2）中，第二轮 PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR稀释产物 1-2μL，双蒸水补齐至50μL。

优选地，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min10s，共34个循环；3）、68℃后延伸5min。

本发明还提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。

本发明的有益效果在于：

本发明的巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变。

本发明的巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性，所得到的PCR产物可直接送去测序，根据序列即可分析巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的情况。

本发明限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序，同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序，最终得到的条带清晰，结果稳定。

本发明通过选用特定的巢式PCR引物，采用巢式PCR方法，优化PCR反应体系和反应程序，扩增巨细胞病毒UL54和UL97基因具有高敏感性，与其它方法比较无非特异性扩增出现，显示高度扩增特异性，可以用于分析其耐药基因突变，实用性强，符合临床推广的要求。

本发明在长期进行病毒研究的基础上，对NCBI上巨细胞病毒序列进行比对分析，对相关引物、反应体系进行优化后，探索出一套特异、准确、操作简便的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法。

附图说明

利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1为巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变位点（Nell S. Lurain et al, Clinical Microbiology Reviews, Oct. 2010），其中A为聚合酶 UL54 基因突变位点示意图，B为UL97 基因的突变位点示意图。图2为巨细胞病毒UL54和UL97基因片段扩增示意图，其中A为UL54 基因的扩增片段示意图，B为UL97 基因的扩增片段示意图。

图3为本发明的电泳图，其中，泳道M为DNA marker,泳道1为UL97基因扩增产物，泳道2和3为UL54基因扩增产物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，见附图1-3。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

本实施例中，一种检测巨细胞病毒UL54基因耐药突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物：

当检测巨细胞病毒UL54时，

第一轮PCR扩增引物为：

第一对引物：正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1；

第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物：

第二对引物：正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2；

第三对引物：正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3；

本实施例， 第一对引物用于扩增UL54基因的第一轮，包括正向引物UL54-SF1 （SEQ ID No.1）和反向引物UL54-SR1（SEQ ID No.2）；第二对引物用于扩增UL54基因的第二轮，包括正向引物UL54-SF2（SEQ ID No.3）和反向引物UL54-SR2（SEQ ID No.4）；第三对引物用于扩增UL54基因的第二轮包括正向引物UL54-SF3（SEQ ID No.5）和反向引物UL54-SR3（SEQ ID No.6）；第一至第三对引物序列分别为:

正向引物UL54-SF1：5'-TGGTCATCGATCGGCGG-3'；

反向引物UL54-SR1：5'-ATGACGGCAATGTGCGG-3' ；

正向引物UL54-SF2：5'-GTTACGACTGGCGGCAGC-3'；

反向引物UL54-SR2：5'-GCAGATTGCAAGGGCGG-3'；

正向引物UL54-SF3：5'-AACCACTACAGCAAAGGTACGACG-3'；

反向引物UL54-SR3：5'-CGACAGGCGCACGGCT-3'；

每个模板DNA均采用以下PCR反应体系和PCR反应程序进行：

一种用于非治疗目的采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL54耐药突变的方法，包括如下步骤：

（1）以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行100倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；所述第一轮PCR扩增引物为第一对引物；

（2）以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；其中，当检测巨细胞病毒UL54基因耐药突变时，所述第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物；

（3）对第二轮PCR产物进行检测。

如图2（A）所示，采用正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1进行第一轮PCR扩增，采用正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2进行第二轮PCR扩增，得UL54-1片段；采用正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1进行第一轮PCR扩增，采用正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3进行第二轮PCR扩增，得UL54-2片段。

所述步骤（1）中，待检测DNA均为从待检血清或血浆中提取DNA而得。

本实施例中，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 2μL，双蒸水补齐至25μL。

所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸2min30s，共34个循环；3）、68℃后延伸5min。

本实施例中，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物2μL，双蒸水补齐至50μL。

所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min10s，共34个循环；3）、68℃后延伸5min。

所述步骤（3）中，检测采用电泳检测，将第二轮PCR产物通过琼脂糖电泳配合凝胶成像系统观察结果。其中，检测的第二轮PCR产物加样量为3μL，其过程按照仪器标准操作程序进行。选择DL2,000marker（TAKARA公司）作为对照，电泳结束后分析电泳图像，第二轮PCR产物送去Invitrogen公司测序。

本实施例还提供一种检测巨细胞病毒UL54耐药突变的试剂盒，该试剂盒包括第一对引物，并且包括第二对引物或者第三对引物中的任一对引物。

实施例2

本实施例中，一种检测巨细胞病毒UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物：

检测巨细胞病毒UL97时，

第一轮PCR扩增引物为：

第四对引物：正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1；

第二轮PCR扩增引物为：

第五对引物：正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2；

本实施例，第四对引物用于扩增UL97基因的第一轮，包括正向引物UL97-SF1（SEQ ID No.7）和反向引物UL97-SR1（SEQ ID No.8）；第五对引物用于扩增UL97基因的第二轮，包括正向引物UL97-SF2（SEQ ID No.9）和反向引物UL97-SR2（SEQ ID No.10）；第四至第五对引物序列分别为:

正向引物UL97-SF1：5'-GTTCCAACGACCAGATCATCAC-3'；

反向引物UL97-SR1：5'-GCGAGCATTCGTGGTAGAAG-3'；

正向引物UL97-SF2：5'-GACCCGCGTATGTTCTTGC-3'；

反向引物UL97-SR2：5'-GACACGAGGACATCTTGGCC-3'；

每个模板DNA均采用以下PCR反应体系和PCR反应程序进行：

一种用于非治疗目的采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL97耐药突变的方法，包括如下步骤：

（1）以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行100倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；所述第一轮PCR扩增引物为第四对引物；

（2）以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；其中，当检测巨细胞病毒UL54基因耐药突变时，所述第二轮PCR扩增引物为第五对引物；

（3）对第二轮PCR产物进行检测。

如图2（B）所示，采用正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1进行第一轮PCR扩增，采用正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2进行第二轮PCR扩增，得UL97片段。

所述步骤（1）中，待检测DNA均为从待检血清或血浆中提取DNA而得。

本实施例中，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 2μL，双蒸水补齐至25μL。

所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸2min30s，共34个循环；3）、68℃后延伸5min。

本实施例中，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物2μL，双蒸水补齐至50μL。

所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min10s，共34个循环；3）、68℃后延伸5min。

所述步骤（3）中，检测采用电泳检测，将第二轮PCR产物通过琼脂糖电泳配合凝胶成像系统观察结果。其中，检测的第二轮PCR产物加样量为3μL，其过程按照仪器标准操作程序进行。选择DL2,000marker（TAKARA公司）作为对照，电泳结束后分析电泳图像，第二轮PCR产物送去Invitrogen公司测序。

本实施例还提供一种检测巨细胞病毒UL97耐药突变的试剂盒，该试剂盒包括第四对引物和第五对引物。

实施例1-2的电泳图像如图3所示，泳道M为DNA marker,泳道1为UL97基因扩增产物，泳道2和3为UL54基因扩增产物。本实施例限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序，同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序，最终得到的条带清晰，结果稳定。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：

本实施例中，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL，双蒸水补齐至25μL。其中，所述第一轮PCR产物，进行50倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物。

本实施例中，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物1μL，双蒸水补齐至50μL。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：

本实施例中，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为10μL。具体地，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL，双蒸水补齐至10μL。其中，所述第一轮PCR产物，进行150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物。

本实施例中，所述步骤（2）中，第二轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物 1μL，双蒸水补齐至25μL。

实施例5

本实施例与实施例2的不同之处在于：

本实施例中，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL，双蒸水补齐至25μL。其中，所述第一轮PCR产物，进行50倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物。

本实施例中，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物1μL，双蒸水补齐至50μL。

实施例6

本实施例与实施例2的不同之处在于：

本实施例中，所述步骤（1）中，第一轮PCR反应体系的体积为10μL。具体地，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL，双蒸水补齐至10μL。其中，所述第一轮PCR产物，进行150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物。

本实施例中，所述步骤（2）中，第二轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物 1μL，双蒸水补齐至25μL。

本发明通过选用特定的巢式PCR引物，采用巢式PCR方法，优化PCR反应体系和反应程序，扩增巨细胞病毒UL54和UL97基因具有高敏感性，与其它方法比较无非特异性扩增出现，显示高度扩增特异性。

本发明限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序，同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序，最终得到的条带清晰，结果稳定。

本发明在长期进行病毒研究的基础上，对NCBI上巨细胞病毒序列进行比对分析，对相关引物、反应体系进行优化后，探索出一套特异、准确、操作简便的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，可以用于分析其耐药基因突变，实用性强，符合临床推广的要求。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110>东莞市第八人民医院东莞市儿童医院 东莞市儿科研究所

<120>检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法

<160>10

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tggtcatcga tcggcgg 17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgacggcaa tgtgcgg 17

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gttacgactg gcggcagc 18

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcagattgca agggcgg 17

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaccactaca gcaaaggtac gacg 24

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgacaggcgc acggct 16

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gttccaacga ccagatcatc ac 22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gcgagcattc gtggtagaag 20

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gacccgcgta tgttcttgc 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gacacgagga catcttggcc 20