本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法。
背景技术：
呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占据主要地位，每年的流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染会导致鼻炎，流涕，鼻塞，咳嗽，轻度咽炎，全身发热等症状，严重的会导致呼吸困难甚至死亡。据世界卫生组织2002年统计报告，呼吸道感染居全球十大死亡原因中第三位，全球每年近四百万人死于呼吸道感染。
基因芯片技术是近年来兴起的生物高新技术，集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、精密控制技术、激光共聚焦显微技术和高分子合成技术。该技术的原型是80年代中期提出的，1991年Stephen Fodor博士首次将该技术定义为基因芯片，到1995年它在《Science》杂志刊登的一篇关于研究分析基因表达图谱的文章中再次被提及，目前该技术在研究癌症和检测微生物方面得到广泛的应用。我们通常所提到的基因芯片(又称DNA芯片、寡核苷酸芯片等)是指根据经过特殊处理技术，将核酸分子(寡聚核苷酸、DNA、RNA等)固定于硅片、玻璃、尼龙膜等固相载体上，利用生物分子间特异相互作用的原理，将生化反应及分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA的高通量快速检测。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和高度自动化。
目前国内已有许多检测呼吸道病原体的试剂。主要是针对于病毒类的PCR荧光检测试剂或者血清免疫检测试剂，而对于细菌类病原体还是采取了比较传统的细菌培养板培养的方法。荧光PCR虽然能够得到较好的灵敏度和特异性，但是由于仪器采集信号通道的限制，每次反应都只能检测几种病原体，通量较低，而采取多管检测的时候又会极大增加检测的经济成本和时间成本；而血清免疫检测试剂虽然可以获得较大的检测通量，但是由于血清免疫检测的是血清中的所产生的抗体，因此存在着一个较长的空窗期，并且灵敏度相对也较低；而对于细菌类病原体的检测则是更加困难，细菌培养法虽然准确率高，但是周期长，培养效果差，很多细菌无法培养，延误了最佳的治疗时机。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于提供一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法，以实现同时检测16种呼吸道病原体的检测需要。
根据本发明的实施例，第一方面示出一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒，所述试剂盒包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；
所述探针包括杂交探针和内标探针；
所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；
所述引物的序列为：SEQ ID NO:1-37；所述探针的序列为SEQ ID NO:38-55。
进一步，每条所述杂交探针的5’末端都经过氨基与多聚polyT修饰。
进一步，每条所述杂交探针的5’端oligodT的C6位置进行氨基化修饰。
本发明第二方面示出一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法，包括：
筛选出16种呼吸道病原体的保守区域，分别得到16对引物，在所述16种呼吸道病原体的保守区域设计出16条杂交探针；
选取方形尼龙膜，使用10％EDC活化1h，将所述16条杂交探针、1种DNA内标探针、1种RNA内标探针点在尼龙膜上，探针排列为3×6矩阵，点与点之间的间距为100μm，得到杂交盒；
配置检测试剂盒，设置PCR反应扩增的程序，进行扩增反应，得到扩增产物；
向所述扩增产物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到变性后的扩增产物；
在杂交盒每孔内加入500uL预杂交液，15min后取出在杂交盒中预杂交液，在杂交盒每孔内加入杂交液400uL，同时相应的加入所述变性后的扩增产物100uL，将杂交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔内的杂交液；在杂交盒每孔内加入500ul杂交洗液1清洗3min，移出杂交洗液1；在杂交盒每孔内加入300ul酶标溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶标溶液；在杂交盒每孔内加入500uL杂交洗液1，震荡清洗3min，用500uL杂交洗液2，震荡清洗3min；在杂交盒每孔内加入400ul显色液，室温显色1-2min，移出显色液，用杂交洗液2清洗每孔，用Bio-rad显影，得到杂交显色结果；
将所述杂交显色结果与标准卡进行对比，得出检测结果；
所述杂交洗液1为2x SSC与0.1％十二烷基硫酸钠溶液的混合溶液；所述杂交洗液2为0.5x SSC与0.1％十二烷基硫酸钠溶液的混合液溶液。
进一步，所述PCR反应扩增的程序为：
逆转录，逆转录的温度为50℃。时间为30min；
cDNA预变性，预变性的温度为90℃-105℃，时间为1-10min，
变性，变性的温度为90℃-105℃，时间为10s-30s；
退火，退火的温度为40℃-65℃，时间为10s-60s；
延伸，延伸温度为40℃-80℃，时间为10s-5min。
进一步，所述PCR反应扩增的程序为：
所述逆转录的温度为50℃。时间为30min；
所述预变性的温度为95℃，时间为2min，
所述变性的温度为95℃，时间为15s；
所述退火的温度为57℃，时间为20s；
延伸温度为72℃，时间为45s。
进一步，在每条所述引物的5’端添加人工接头序列。
进一步，所述酶标溶液为链霉亲和素和酶标母液的混合液；按照链霉亲和素酶标母液＝1:200的配制。
进一步，所述显色液为2mg/ml TMB：显色缓冲液：30％H2O2＝500:500:1。
进一步，所述预杂交液、所述杂交液、所述杂交洗液1，所述杂交洗液2和所述酶标溶液使用前在55℃烘箱中预热30min。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法，所述试剂盒包括：包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQ IDNO:1-37；所述探针的序列为SEQ ID NO:38-55。本发明基于PCR技术，针对16种呼吸道病原体的保守区域设计引物(SEQ ID NO:1-37)对靶核酸序列进行扩增，并通过基因芯片杂交技术对扩增产物进行杂交和显色，最后将基因芯片上杂交斑点显色情况与标准卡进行对比，从而对检测结果进行分析判断，同时为了避免由于样本提取或者试剂失效导致的假阴性结果，本发明设置了人源管家基因(在取样过程中会取到人源上皮细胞)作为内标质控，对靶核酸的提取和扩增进行监控，从而保证检测结果的精确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据一优选实施例示出的一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒，包括：PCR缓冲溶液、DNA聚合酶、dNTPs、引物、探针以及催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；
所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；
所述引物的序列为：SEQ ID NO:1-37；
所述探针的序列为SEQ ID NO:38-55。
进一步，每条所述杂交探针的5’末端都经过氨基与多聚polyT修饰。
进一步，每条所述杂交探针的5’端oligodT的C6位置进行氨基化修饰。
本发明的基因芯片上具有与所检测的16中呼吸道病原体DNA/RNA互补的核苷酸序列的探针(SEQ ID NO:38-55)。为了增强杂交探针与基质的结合度，有利于后续与扩增产物的杂交反应的进行，每条杂交探针都经过5’末端氨基与多聚polyT修饰。本发明针对16中病原体和2种内标18种杂交探针，每条杂交探针都有着合适的碱基成分，Tm值相对比较均一，即18种型别的杂交探针和对应的PCR产物杂交时的最适杂交条件基本一致，不会因为不同杂交探针所匹配的最适杂交温度不同从而影响杂交结果，保证了检测的准确性。而在扩增方面，我们在每一对扩增引物的5’末端都加入了一段人工合成的接头序列，该序列与现有基因库中基因组无特异性结合，并在接头序列的5’末端进行生物素标记。先通过带接头序列的特异性引物将靶标基因进行扩增富集，再通过接头序列对富集的模板进行扩增。从而导致了在反应的最后扩增阶段反应体系中只有一对扩增引物，避免了不同引物对之间由于扩增效率不同而导致出现假阴性的情况，实现了所有靶标的同步扩增。
本发明实施例第二方面示出一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法，如图1所示所述方法包括：
S101筛选出16种呼吸道病原体的保守区域，分别得到16对引物，在所述16种呼吸道病原体的保守区域设计出16条杂交探针；
S102选取方形尼龙膜，使用10％EDC活化1h，将所述16条杂交探针、1种DNA内标探针、1中RNA内标探针点在尼龙膜上，探针排列为3×6矩阵，点与点之间的间距为100μm，得到杂交盒；
S103配置检测试剂盒，设置PCR反应扩增的程序，进行扩增反应，得到扩增产物；
S104向所述扩增产物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到变性后的扩增产物；
S105在杂交盒每孔内加入500uL预杂交液，15min后取出在杂交盒中预杂交液，在杂交盒每孔内加入杂交液400uL，同时相应的加入所述变性后的扩增产物100uL，将杂交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔内的杂交液；在杂交盒每孔内加入500ul杂交洗液1清洗3min，移出杂交洗液1；在杂交盒每孔内加入300ul酶标溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶标溶液；在杂交盒每孔内加入500uL杂交洗液1，震荡清洗3min，用500uL杂交洗液2，震荡清洗3min；在杂交盒每孔内加入400ul显色液，室温显色1-2min，移出显色液，用杂交洗液2清洗每孔，用Bio-rad显影，得到杂交显色结果；
S106将所述杂交显色结果与标准卡进行对比，得出检测结果；
所述杂交洗液1为2x SSC与0.1％十二烷基硫酸钠溶液的混合溶液；所述杂交洗液2为0.5x SSC与0.1％十二烷基硫酸钠溶液的混合液溶液。
进一步，在每条所述引物的5’端添加人工接头序列。
进一步，所述酶标溶液为链霉亲和素和酶标母液的混合液；按照链霉亲和素酶标母液＝1:200的配制。
进一步，所述显色液为2mg/ml TMB：显色缓冲液：30％H2O2＝500:500:1。
进一步，所述预杂交液、所述杂交液、所述杂交洗液1，所述杂交洗液2和所述酶标溶液使用前在55℃烘箱中预热30min。
具体的，本发明的优选方案配置检测试剂盒为：
本发明的检测方法采取RT-PCR与基因芯片相结合的方式，因此首先需要完成PCR反应扩增的过程。一般的RT-PCR反应过程为：
1)逆转录；2)cDNA预变性，时间和长度取决于靶核苷酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃-105℃，时间一般为1-10min，预变性的目的为使双链核苷酸序列彻底分离为单链；3)变性，温度一般为90℃-105℃，时间一般为10s-30s；4)退火，使各引物退火至呼吸道病原体或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃-65℃，退火的时间可以是10s-60s；5)延伸，引物与模板结合，开始合成新的双链DNA，延伸温度一般为40℃-80℃，延伸时间可以是10s-5min。本发明由于涉及到人工接头引物的引入和扩增，根据需要对扩增步骤进行了略微的修改。本发明的优选方案为：
本发明的关键内容为靶核苷酸以及内标的特异性扩增引物和接头引物，以及后来的杂交探针。
本发明中的核苷酸序列为：
本发明中的保护点为本发明中提供的核苷酸序列或部分序列(引物、探针及内标)及与其相似的序列或反向互补的序列，以及PCR反应体系组分及浓度参数、PCR扩增程序、芯片杂交反应体系组成成分、浓度参数以及杂交反应条件。
结果分析：
证明该发明方法的可行性，进行了方法学研究：
⑴最低检测限(LOD)试验；
通过对各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)为1000copies/mL。
(2)特异性实验与其它疾病的交叉反应情况；
通过用本发明中的检测方法对16种呼吸道病原体以外的其它病原体进行检测，结果表明本发明中的方法对EB病毒、HPV病毒、STD等病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特意性。
(3)对潜在内源物质的抗干扰性；
试验表明，当检验人中含有以下浓度的药物，不会影响到试剂盒对样本检测结果的判定：0.2mg/L倍氯米松、0.15mg/L地塞米松、12mg/L曲安西龙、0.4mg/L布地奈德、0.05mg/L莫美达松、0.5mg/L氟替卡松、75mg/L苯佐卡因、5mg/L扎那米韦、37.5mg/L奥司他韦、75mg/L妥布霉素、50mg/L金刚烷胺、75mg/L硫磺、150mg/L金英、50mg/L盐酸金刚乙胺、0.125mg/L肾上腺素、25mg/L薄荷脑、0.05％羟甲唑啉、500mg/L氟尼缩松、500mg/L莫匹罗星。
(4)对潜在外源物质的抗干扰性
试验表明，常见干扰物质，如血液、唾液、鼻分泌物在分别在10％时，不会对试剂盒检测结果产生影响。但考虑上述干扰物质中的RNA酶的影响，仍提醒采样时应尽量避免上述物质的干扰。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法，所述试剂盒包括：包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQ IDNO:1-37；所述探针的序列为SEQ ID NO:38-55。本发明基于PCR技术，针对16种呼吸道病原体的保守区域设计引物(SEQ ID NO:1-37)对靶核酸序列进行扩增，并通过基因芯片杂交技术对扩增产物进行杂交和显色，最后将基因芯片上杂交斑点显色情况与标准卡进行对比，从而对检测结果进行分析判断。同时为了避免由于样本提取或者试剂失效导致的假阴性结果，本发明设置了人源管家基因(在取样过程中会取到人源上皮细胞)作为内标质控，对靶核酸的提取和扩增进行监控，从而保证检测结果的精确性。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片及检测用试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> Human Rhinovirus
<400> 45
tttttttttt cagctagatc agtcgtagca taatcttc 38
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 1
<400> 46
tttttttttt cacagccatc aacagtcgtt ggcat 35
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 2
<400> 47
tttttttttt tgacgccgcg gtgcggctg 29
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 3
<400> 48
tttttttttt cgtcagaatg ggtgctattg atggc 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> Pertussis
<400> 49
tttttttttt ccaaagactt gttgaccttg cctgt 35
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 50
tttttttttt ctcccagctt aagaaccgtc agacaga 37
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> HaemoPhilus influenza
<400> 51
tttttttttt cttcgttgaa atagtaccac ttatcagcga 40
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> Moraxella Catarrhalis
<400> 52
tttttttttt aacacggaaa tcacgacctg cccca 35
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> Streptococcus Pneumoniae
<400> 53
tttttttttt cctaacgcga tgttgtattc tggtg 35
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tttttttttt tcaatgtcgg attgatgaaa cccag 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tttttttttt ggcatactca tctttttcag tgggg 35