一种鉴别PRRSV的多重RT‑PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于动物病毒分子生物学技术领域，具体是一种鉴别检测PRRSV经典株、高致病性变异株与高致病性疫苗株（JXA1-R株）的多重RT-PCR检测试剂盒，适用于临床或科研中鉴别检测样品是否是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）感染，亦或是其中两者或三者的共同感染。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。

1991年，荷兰学者Wensvoort等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。目前，猪繁殖与呼吸综合征已在世界范围内流行，我国自1996年以来普遍存在该病。2006年6月起，我国南方一些省份的猪场暴发了一种“高热”综合征，发病猪的体温高于41℃，病猪食欲不振甚至废绝，腹部、耳尖及后躯发红，发病率达70%～100%，死亡率达50%～100%不等。该病传播迅速，在短短的半年内几乎传遍了大半个中国，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

由于PRRSV在流行过程中经常发生演化重组，不同来源的PRRSV基因的重组产生了大量的中间毒株，包括野毒间的重组毒株、疫苗毒株和野毒株的重组毒株、以及疫苗毒株演化而来的毒株。这种变化使得病毒的致病力持续增强，疫病防控的难度也逐渐加大。

传统的猪繁殖与呼吸障碍综合征的诊断方法有多种，如检测病原的有病毒分离、免疫组化、免疫荧光试验等方法，检测抗体的有ELISA、血清病毒中和试验、间接免疫荧光试验、免疫过氧化酶单层试验等血清学方法，但这些诊断方法不同程度地存在诸如敏感性低、特异性差、需时长、无法区分PRRSV的不同毒株感染等的局限性。国内外已建立了针对所有PRRSV的RT-PCR方法，但此种方法只能检测是否有PRRSV感染，无法判断是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，亦或是两者共同感染。此外，已有的针对PRRSV高致病性变异株的RT-PCR检测方法，只能检测出PRRSV高致病性变异株，无法判断是单一的PRRSV高致病性变异株感染，还是PRRSV经典株、高致病性变异株亦或是高致病性疫苗株的共同感染。因此，建立一种简便、快速、特异性强、敏感性高的PRRSV经典株、高致病性变异株与高致病性疫苗株的鉴别检测方法意义重大。

技术实现要素：

本发明公开了一种鉴别PRRSV的多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒只需一次扩增反应就可同时检测出样本中是否含有PRRSV JXA1-R、经典株和高致病性变异株，临床应用操作便捷，实用性强，经济实惠，适合于养殖场和专业实验室对PRRSV病毒株的快速鉴定，同时可为PRRS的疫情监测、流行病学调查及综合防控提供强有力的技术支持。

本发明所采取的技术方案是：一种用于鉴别PRRSV的多重RT-PCR检测试剂盒，包括5×M-MLV反转录Buffer、M-MLV反转录酶、dNTP Mixture、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、两对引物和DEPC水；

引物是根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列，在其NSP2基因保守序列区域及JXA1-R株与其它高致病性PRRSV毒株13380-13900 nt区域设计的两对特异性引物。

所述试剂盒还包括阳性对照，阳性对照为将猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病性毒株及高致病性疫苗株（JXA1-R株）分别接种Marc-145细胞后，收集48-72小时细胞培养物，测定TCID₅₀，通过β-丙内酯灭活后，三种毒株混合至最终含量均为10⁴ TCID₅₀/mL。

应用所述试剂盒检测待检样品中是否含有PRRSV的方法，包括如下步骤 ：

1、病毒RNA的提取

采用Trizol法提取，分别取美洲型PRRSV国内分离株CH-1a、PRRSV高致病性变异株07HBEZ、PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的细胞培养液各400 μL，冻融2-3次，加800 μL Trizol，室温作用5 min；加入200 μL氯仿，室温作用10 min；4℃，12000 rpm，离心15 min；吸取上清液，加入等体积异丙醇，-20℃作用10 min；4℃，12000 rpm，离心15 min；弃上清液，加入1 mL75%乙醇，8000 rpm，离心5 min；弃乙醇，晾干，即得病毒基因组总RNA，立即反转录或置-20℃保存备用。

2、反转录合成cDNA

cDNA 的合成体系采用20 μL体系, 其中含2μL RNA, 5×M-MLV反转录Buffer 4 μL, 10 mM dNTP 2 μL, M-MLV反转录酶1 μL (100U)，Random Primer 1 μL(30 pM/μL) Rnasin 0.5 μL, 再用DEPC水补至20 μL，42℃ 1h，95℃ 5 min灭活反转录酶，即得cDNA，立即进行PCR或置于-20℃保存备用。

3、多重RT-PCR

以病毒基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25 μL体系，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL（NSP2-F：5’-TGAYGGGCGACAATGTCC-3’；

NSP2-R：5’-CGCAGACAAATCCAGAVG-3’；JXA1-F：5’-ATTTGAATGTTCGCACGGTC TC

-3’；JXA1-R：5’- CCGCTGAAACTCTGGTTAAAGG-3’），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板cDNA 2.5μL，用DEPC水补至25 μL。扩增循环参数为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

4、琼脂糖凝胶电泳及结果判定

取PCR产物7 µL于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压80-120 V，时间15-20 min，根据电泳图像判断检测结果。根据电泳图按照PRRSV普通株的目的条带为319 bp，PRRSV高致病性毒株的目的条带为229 bp，PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的目的条带为229 bp 和610 bp，判定是PRRSV三种毒株的单独感染或是混合感染。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明利用两对引物鉴别美洲型 PRRSV经典株、高致病性变异株和高致病性疫苗株（JXA1-R株）三种毒株，减少了鉴定不同PRRSV病毒株的检测成本和检测时间；且只需一次PCR反应即可鉴别出三种PRRSV毒株，解决了临床样品检测中无法区分PRRSV经典株、高致病性变异株和高致病性疫苗株（JXA1-R株）单独感染亦或共同感染的问题。

2、本发明具有敏感性高、特异性强，可重复性好等诸多优势，仅对PRRSV的核酸产生特异性的扩增反应，对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪轮状病毒等均无扩增反应，试剂盒的可检测出RNA样品的浓度为96 copies/反应。

3、简便快速，仅需约1个小时，加上核酸的提取和琼脂糖凝胶检测，共需约2小时。

4、经济实惠，仅需一次PCR扩增即可鉴别出PRRSV的三种毒株，对于需要同时检测PRRSV三种毒株的样本来说，成本降低了约2/3。

5、本发明为我国PRRSV的临床检测提供了新手段，该试剂盒可用于种猪流通环节中PRRSV的检验检疫，养殖环节中的PRRSV的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化，为提升我国PRRSV的综合防控水平提供了技术支撑。

附图说明

图1：PRRSV多重RT-PCR特异性试验结果，注：M:DL2000 Marker；1-10： PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV普通株CH-1a、PRRSV高致病性变异株07HBEZ、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪轮状病毒（RV）及阴性对照（H₂O）。

图2： PRRSV多重RT-PCR敏感性试验结果，注：M:DL2000 Marker；1-7:384, 192, 96, 48, 24, 12, 6 copies/反应。

图3：PRRSV多重RT-PCR临床检测电泳图，注：M:DL2000 Marker；1-4：PRRSV高致病性变异株、PRRSV高致病性疫苗株、PRRSV普通株及阴性对照（H₂O）。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例仅用于说明本发明，不会限制权利要求书所详细描述的本发明。

本发明研究过程中用到的病毒毒株包括：猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪轮状病毒（RV）均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供。

病毒特异性引物设计：所述的病毒特异性引物，指的是根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列，在其NSP2基因保守序列区域及JXA1-R株与其它高致病性PRRSV毒株13380-13900 nt区域设计的与其基因高度保守区的特异性片段完全相同或者反向互补。

本发明所列的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

实施例1 PRRSV多重RT-PCR鉴别方法的特异性试验

用复合RT-PCR方法检测6株其它猪源病毒毒株6份，1份PRRSV经典株CH-1a，1份PRRSV高致病性变异株07HBEZ，1份PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R，以考查该方法检测不同样品的特异性。

1 病毒株

PRRSV经典株：美洲型PRRSV国内分离株CH-1a，由中国科学院武汉病毒研究所提供；PRRSV高致病性变异株：由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的07HBEZ (GenBank ID: FJ495082.2)；PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R：购自市售疫苗，经Marc-145细胞培养增殖后用于本发明；其它猪病病毒：猪瘟病毒 (CSFV)， 猪伪狂犬病毒(PRV)，猪圆环病毒2型(PCV2)，猪细小病毒 (PPV)，猪日本乙型脑炎病毒 (JEV) 和猪轮状病毒(RV)。

2 病毒培养

将冻存的美洲型PRRSV国内分离株CH-1a和PRRSV高致病性变异株07HBEZ取出，加入适量含10％小牛血清的细胞培养液稀释后，接种于生长良好的Marc145细胞单层，37℃吸附1h，加入含2％小牛血清的细胞维持液继续培养3-5d，观察细胞病变（CPE），待出现典型细胞病变达70％时收毒，-70℃保存备用；PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R取自市售疫苗，无菌操作经0.22 µm滤膜过滤后按前述方法培养。其它病毒分别接种适应细胞进行培养。

3 病毒RNA的提取

采用Trizol法提取，分别取美洲型PRRSV国内分离株CH-1a、PRRSV高致病性变异株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及其它病毒的细胞培养液各400μL，冻融2-3次，加800μL Trizol，室温作用5 min；加入200μL氯仿，室温作用10 min；4℃，12000 rpm，离心10 min；吸取上清液，加入等体积异丙醇，-20℃作用5 min；4℃，12000 rpm，离心10 min；弃上清液，加入1 mL75%乙醇，8000 rpm，离心5 min；弃乙醇，晾干，即得病毒基因组总RNA，立即反转录或置-20℃保存备用。

4 阴性对照

取灭菌的DEPC水，置-20℃保存备用。

5 PRRSV复合RT-PCR检测方法的操作程序

25 μL反应体系，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 2 μL，上、下游引物（NSP2-F：5’-TGAYGGGCGACAATGTCC-3’；NSP2-R：5’-CGCAGACAAATCCAGAVG-3’；JXA1-F：5’-ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC-3’；JXA1-R：5’- CCGCTGAAACTCTGGTTAAAGG-3’）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板cDNA 2.5μL，用DEPC水补至25 μL。扩增循环参数为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

6 电泳

称取1 g琼脂糖放入500 mL锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液100 mL，于微波炉中熔解，再加入5 μL染色液混匀。在电泳槽模内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将PCR扩增产物5 μL混合1 μL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以80-120V电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。

7 结果判定

PRRSV普通株的目的条带为319 bp，PRRSV高致病性变异株的目的条带为229 bp，PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的目的条带为229 bp 和610 bp、阴性对照无条带（引物带除外）时，实验结果有效。

8 结果

用PRRSV复合RT-PCR方法检测6株其它猪源病毒毒株，结果均为阴性，PRRSV经典株CH-1a，PRRSV高致病性变异株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）均扩增出目的条带，而阴性对照DEPC水未扩增出任何目的带（见图1）。

实施例2 PRRSV多重RT-PCR鉴别方法的敏感性试验

用复合RT-PCR方法检测不同含量的PRRSV经典株CH-1a， PRRSV高致病性变异株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R，以考查该方法检的敏感性。

1 病毒

PRRSV经典株CH-1a，PRRSV高致病性变异株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R。

2 方法

将PRRSV经典株CH-1a、PRRSV高致病性变异株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R分别稀释为384, 192, 96, 48, 24, 12, 6 copies/反应，提取RNA，按前述PRRSV复合RT-PCR扩增每个稀释度样品。

3 结果

用PRRSV复合RT-PCR扩增检测不同稀释度样品的结果见图2。结果表明该PRRSV复合RT-PCR的敏感性为96 copies/反应。

实施例3 应用PRRSV复合RT-PCR方法检测临床样品

分别检测PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及PRRSV高致病性野毒株阳性组织样品各3份，同时重复检测3次，并设双蒸水作为阴性对照，以检测该方法的稳定性。

1 材料

PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及PRRSV高致病性野毒株阳性组织样品各3份。

2 方法

采用Trizol法分别提取PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV高致病性野毒株阳性组织样品的RNA，按前述复合RT-PCR扩增每个样品。

3 结果

PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV高致病性野毒株阳性组织样品的cDNA均扩增出与预期大小一致的目的条带，阴性对照无任何条带产生（图3），说明该鉴别诊断方法稳定性好，可直接应用于临床。

<<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种鉴别PRRSV的多重RT-PCR检测试剂盒

<160>4

<210>1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211>18

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