非洲猪瘟病毒的实时等温重组酶聚合酶扩增检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种采用实时等温重组酶聚合酶扩增快速检测非洲猪瘟病毒的方法以及相应的检测试剂盒。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪的急性、热性、高度接触性传染病，可感染所有品种和年龄段的家猪和野猪。ASF的高发病率，高死亡率，发生后对国际贸易限制造成的巨大经济损失，以及目前缺少有效疫苗，使ASF成为目前危害养猪业最严重的疫病之一。ASFV目前是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)，非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是目前已知唯一的DNA虫媒病毒。ASFV基因组为线性dsDNA分子，大小为170～193kb，编码蛋白在151～167个之间，通过对病毒VP72基因C末端测序，将目前分离的ASFV分为22个基因型。

ASF自1921年首次在肯尼亚报道以来，目前在拉哈拉以南非洲的至少26个国家呈现地方性流行，并已经跨大陆传播到亚洲、欧洲和南美洲部分国家。ASF的流行病学非常复杂，具有非常高的传染性，既可以通过直接接触发病动物或者其分泌物、排泄物感染，也可以通过软蜱传播。ASFV对组织和环境具有非常高的抵抗力，从而使得病毒可以通过残羹和垃圾喂猪实现长距离的传播。ASFV感染力可以在冻肉中保持1000天，在室温下存放的腐败血中保持12周，在猪圈中保持1个月。钝缘蜱属(Ornithodoros)软蜱既是病毒的储藏宿主，也是病毒的传播媒介。这些软蜱既可以在家养环境的猪舍中定殖，也可以在野外哺乳动物洞穴中定殖。猪发生ASF后，无法通过临床症状或剖检症状同古典猪瘟(Classical swine fever virus，CSFV)进行区别。目前对ASF没有有效的治疗方式或疫苗，对其控制只能依赖于快速的实验室诊断，发病动物的捕杀，有效的检疫措施和严格的卫生措施。

一系列事实表明，对ASFV快速有效的检测对于控制ASF，防止其造成巨大经济损失，具有极其重要的意义。随着分子诊断技术的发展，目前已经建立多种具有不同特异性和敏感性的ASFV检测方法，如PCR、real-time PCR、LAMP等。但是上述方法或者需要昂贵的仪器设备，技术娴熟的技术人员，比较费时，或者需要复杂的引物和探针设计，反应试剂需要冷链运输和保存，从而不能有效应用于野外现场检测。

目前ASF在俄罗斯持续存在和蔓延，在非洲国家也不断发生。自至2016年3月11日，俄罗斯22个地区发生91起野猪和81起家猪ASF疫情，341头野猪和3150头家猪感染。目前我国尚无ASF的报道，但是我国与俄罗斯存在4300多公里的边境线，同时中非贸易以及联系进一步加强，我国非洲猪瘟传入风险进一步增加。因此，建立一种简便、快速、有效、可用于现场诊断的ASFV RPA检测方法，对于我国ASF的防控工作具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种采用实时等温重组酶聚合酶扩增方法快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:

本发明的一个优选方面，首先该试剂盒提供了一种通过实时等温重组酶聚合酶扩增方法检测非洲猪瘟病毒的引物和探针组合，其特征在于，其正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列如SEQ ID NO：2所示，探针序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，本发明还提供了将上述的引物和探针组合在检测非洲猪瘟病毒试剂盒或检测试剂中上的应用

本发明的另一个优选方面，还提供了包含上述的引物和探针组合的试剂盒。

进一步地，上述试剂盒为实时等温重组酶聚合酶扩增检测试剂盒。

更近一步地，上述试剂盒还包括总病毒DNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括MgAc，蒸馏水，Buffer，重组酶、聚合酶和单链结合蛋白的冻干酶制剂，阴性对照和阳性对照。

再进一步地，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒基因组DNA的提取液，阴性对照为蒸馏水。

本发明的另一个优选方面，本发明还提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒的实时等温重组酶聚合酶扩增方法，该方法包括提取待测样品的DNA作为模板，利用上述的引物和探针组合进行快速扩增以及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所测样品里含有非洲猪瘟病毒的步骤。

进一步地，上述步骤中向实时等温重组酶聚合酶扩增反应的50μL反应体系中加入浓度10μM的正向引物2.1μL，浓度10μM的反向引物2.1μL，浓度10μM的探针0.6μL，Buffer 29.5μL，蒸馏水12.2μL，混匀后转入含有重组酶和单链结合蛋白冻干酶制剂的0.2mL反应管中，将1μL模板，2.5μL MgAc加入该反应管中。

扩增条件为：等温扩增荧光检测仪或荧光定量PCR仪39℃反应20min。

更进一步地，上述步骤中所使用的等温扩增荧光检测仪为便携式基因扩增仪Genie III。

再进一步地，上述方法具体的操作步骤如下：配制50μL等温重组酶聚合酶扩增反应体系，其中RPA-F和RPA-R浓度为420nM，exo探针浓度为120nM，MgAc浓度为14mM；

将模板和MgAc之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2mL反应管中，并充分均匀；

将1μL模板加入反应管中，并将2.5μL MgAc加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，放入Genie III中，39℃反应20min；

在扩增过程实时收集检测荧光信号。

本发明建立了一种新的、快速的用于ASFV检测的实时等温扩增方法—实时RPA方法。同目前已有的检测方法相比，实时RPA方法具有下列优势：第一，试剂使用方便，易于保存。RPA核心试剂以冻干颗粒形式保存，从而避免了冷藏保存和冷链运输；第二，反应时间短。实时RPA一般能够在15min内完成检测，而PCR反应时间一般需要60min以上；第三，等温扩增。RPA属于等温扩增技术，不需要复杂的反应程序；第四，引物和探针耐受突变的程度大。实时RPA使用的引物和探针能够耐受5～9个碱基的突变，而对扩增效果没有影响。实时荧光PCR使用的探针序列如果出现碱基突变，则会造成检测失败或敏感性降低；第五，可应用于便携式基因扩增设备，进而适用于野外、现场检测。目前的便携式基因扩增设备，均能够实现对探针反应体系中荧光信号的收集、检测和分析，同时体积小、重量轻，便于携带，非常适用于野外、现场的检测。这些特点使得本发明建立的RPA方法可以用于疫情发生现场的ASFV快速检测和诊断。确诊时间的缩短对于及时采取有效措施防止疫情扩散，恢复正常贸易具有重要意义。

附图说明

图1为ASFV实时RPA方法的特异性试验结果图，图中，1为ASFV的扩增曲线，2为PRV的扩增曲线，3为PCV-2的扩增曲线，4为PRRSV的扩增曲线，5为CSFV的扩增曲线，6为FMDV的扩增曲线，7为porcine genome DNA的扩增曲线；以及

图2为ASFV实时RPA和实时荧光PCR方法的敏感性试验结果图，其中，图2A为ASFV实时RPA的敏感性试验结果图，图2B为实时荧光PCR方法的敏感性试验结果图，图中，1为10⁶copies的扩增曲线，2为10⁵copies的扩增曲线，3为10⁴copies的扩增曲线，4为 10³copies的扩增曲线，5为 10²copies的扩增曲线，6为10¹copies的扩增曲线，7为 10⁰copies的扩增曲线。

具体实施方式

本发明为了克服现有技术检测非洲猪瘟病毒的缺陷，提供了一种重组酶聚合酶扩增方法，该方法是一种新的等温基因扩增技术，重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动NDA合成。同PCR一样，两条引物可以启动对靶基因的级数级扩增。实时RPA反应体系中需要加入exo探针，扩增过程中产生的荧光信号通过荧光检测仪实现实时检测。

下面结合具体实施例对本发明进行说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴：

实施例1 ASFV实时RPA方法的特异性和敏感性试验

1.1主要试剂

TwistAmp^TM DNA amplification kit，购自英国TwistDx公司；病毒DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex Taq、感受态细胞DH5α，均购自Takara公司；其它所需试剂由本实验室提供。

1.2主要仪器

等温扩增荧光检测仪(Genie III)，英国Optigene公司；实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)，美国ABI公司；核酸蛋白分析仪(BioPhotometer Plus)，德国Eppendorf公司；小型台式离心机(SIGMA 1-14)，德国Sigma公司；电热恒温水槽(DK-8D)，上海一恒科技有限公司。

1.3 P72基因重组质粒与病毒基因组

根据Genbank中ASFV(AY578706)参考序列，确定P72基因(1941bp)序列信息(SEQ ID NO：7)，由上海生工合成并克隆至pUC57载体，命名为pUC57-P72。将pUC57-P72质粒转化至感受态细胞DH5α，过夜培养后提取纯化并测定浓度。

1.4实时RPA引物和探针的设计与合成

参考GenBank中ASFV P72基因序列(AY578706)，选择特异性保守区域，设计RPA引物和exo探针，目的片段大小为220bp。同时合成OIE参考实时荧光PCR方法的引物和探针。所有引物和探针均由上海生工合成(表1)。

表1引物和探针序列信息

1.5实时RPA反应体系及条件

使用TwistAmpTM exo kit配制50μL实时RPA反应体系，其中RPA-F和RPA-R浓度为420nM，exo探针浓度为120nM，MgAc浓度为14mM。将模板和MgAc之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2mL反应管中，并充分均匀。将1μL模板加入反应管中，并将2.5μL MgAc加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，放入Genie III中，39℃反应20min。在扩增过程实时收集检测荧光信号，目的基因扩增后荧光信号会明显增加。

1.6特异性和敏感性试验

以FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA，以及pUC57-P72作为模板，通过实时RPA方法进行检测，实验结果见图1。

通过图1可见，以FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA，以及pUC57-P72作为模板，进行ASFV实时RPA检测，结果只有pUC57-P72出现特异性扩增曲线，说明该方法具有良好的特异性。

此外，本发明中人工合成ASFV P72基因全长序列并构建克隆载体，pUC57-P72，作为试验的阳性模板。在实时RPA试验中，仅需要3～9min即可实现对10⁶～10²copies的pUC57-P72的成功扩增和检测，并且在反应结束时出现荧光信号的急剧增强。在TwistAmp^TM exo探针的实时RPA反应过程中，聚合酶和exonuclease III对扩增产物处于竞争的关系。当反应临近结束时，体系中能量耗尽，exomuclease III开始占据主导地位，进而迅速切割exo探针，导致荧光信号的迅速增加。

特异性试验表明，所建立的实时RPA仅能对pUC57-P72产生特异性扩增曲线，而对包括CSFV在内的其他常见猪重要病毒核酸没有任何扩增。

将重组质粒pUC57-P72进行10倍倍比稀释，使其浓度在10⁶～10⁰copies/μL之间，以1μL作为模板进行实时RPA反应，确定该方法的最低检测浓度。同时与OIE参考实时荧光PCR方法敏感性进行比较。上述实验结果见图2，该结果表明，实时RPA最低可以检测到10²拷贝质粒(图2A)，同OIE推荐实时荧光PCR方法一致(图2B)。

该结果还表明，实时RPA的敏感性同OIE推荐real-time PCR一致，最低检测浓度均为10²拷贝。进一步使用人工模拟样品对实时RPA方法进行验证，结果表明，RPA检测结果同OIE推荐的实时荧光PCR方法结果一致，但是RPA所用时间不到15min，远远快于实时荧光PCR方法。

实施例2对临床模拟样品的检测

35份临床全血样品均来自河北不同地区养猪场，并经OIE推荐的实时荧光PCR方法确认为ASFV阴性。将10⁷copies～10²copies P72基因重组质粒分别加到35份200μL猪全血样品中，每个浓度5个平行，充分混匀，剩余5份不作处理作为对照。使用天根公司病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，使用30μL ddH₂O进行溶解，取3μL作为模板进行实时荧光PCR和实时RPA检测。实验结果见表′：

表2 ASFV实时RPA和实时荧光PCR方法对模拟样品检测结果比较

TT:阈值时间；Ct:阈值周期

ND：未出现扩增曲线

通过表2可见，实时RPA和实时荧光PCR方法对35份ASFV模拟样品检测结果一致，对5份质粒添加浓度为10²copies、5份未处理样品，均未检出；对质粒添加浓度在10⁷～10³copies的样品，均成功获得特异性扩增曲线(表2)。通过表2还可以得出，实时RPA在3～10min内完成对目的基因的检测，而实时荧光PCR方法的Ct值在23.67～34.22之间，所需时间在53～77min之间，明显的长于实时RPA所用时间(表2)。

此外，本发明建立的ASFV实时RPA检测方法，由于其等温扩增的特性，不仅可以应用于设备环境良好的实验室，而且可以应用于设备条件较差的基层实验室，或者应用于疫病发生现场的检测。实时RPA反应快速，一般能够在20min内完成检测。本发明中使用的便携式基因扩增仪，Genie III，体积为250(L)×165(W)×85(H)mm，重量仅为1.75Kg，可触屏操作，内置长航时锂电池，便于携带，非常适合于现场实时检测。便携式设备的使用和检测的快速性，使本研究建立的ASFV实时RPA检测方法能够在ASF的现场诊断和野外疫情监测中发挥重要的作用。同时，目前世界范围内ASF的发生主要集中在不发达国家和地区，操作简便、反应快速和成本低廉的ASFV RPA实时检测方法意义更大。

实施例3检测试剂盒的组成

该试剂盒中的制品(50次量)：

正向引物，浓度10μM 110μL

反向引物，浓度10μM 110μL

探针，浓度10μM 35μL

含有聚合酶、重组酶和单链结合蛋白冻干酶制剂的0.2ml的tube管50个

MgAc，浓度280mM 140μL

缓冲液 2ml

蒸馏水 5ml。

序列表

<110> 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 北京佰鸥创投生物科技有限公司

<120> 一种快速检测非洲猪瘟病毒的实时等温重组酶聚合酶扩增方法

<130> P1610145

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccgaaggga atggatactg agggaatagc aa 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcccgagaac tctcacaata tccaaacagc ag 32

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaacattacg tcttatgtcc agatacgtgg ccgtgatagg agtga 45

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gataccacaa gatcaggccg t 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccacgggagg aataccaacc cagtg 25

<210> 7

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttaggtactg taacgcagca cagctgaacc gttctgaaga agaagaaagt taatagcaga 60

tgccgatacc acaagatcag ccgtagtgat agaccccacg taatccgtat cccaactaat 120

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