一种霍乱弧菌环介导等温扩增试剂盒及其应用的制作方法

技术领域：
本发明涉及微生物检测
技术领域：
，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术：
：弧菌属(Vibrio)中霍乱弧菌(V.cholerae)可引起一种烈性肠道传染病，发病急、传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈"米泔水样"并含大量弧菌，此为本病典型的特征。居住拥挤，卫生状况差，特别是公用水源是造成暴发流行的重要因素。人与人之间的直接传播不常见。在正常胃酸条件下，如以水为载体，需饮入大于1010个细菌方能引起感染；如以食物作为载体，由于食物高强度的缓冲能力，感染剂量可减少到102~104个细菌。任何能降低胃中酸度的药物或其他原因，都可使人对霍乱弧菌感染的敏感性增加。对霍乱弧菌进行快速检测，有利于临床上快速做出治疗应对措施，对食品进行霍乱弧菌检测，切除传染源，对保障公共卫生安全有重大意义。目前，霍乱弧菌的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定。从样品中分离病原菌需要耗费大量的时间和相对苛刻的操作环境条件，且分离率低。鉴定霍乱弧菌的生化指标主要包括：革兰氏染色、氧化酶实验、过氧化氧酶实验、V-P反应(福格斯-普利斯考尔)产物实验，生化试验通常耗时24-72小时。目前也有PCR检测方法报道。通常以霍乱肠毒素(choleraenterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作为靶基因。然而，一些非产毒株(如环境来源的菌株)有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。此外，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因(tcpA)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表达调控基因(toxR)等也被选用为PCR的靶基因。虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和现场检测，此外，在结果判定上需要先进行琼脂糖凝胶电泳，再使用紫外透射仪照射进行判定，且通过肉眼判定具有人为主观因素，还容易造成实验室污染。技术实现要素：本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测霍乱弧菌的方法，公开一种快速、实时定量的定量检测霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种霍乱弧菌环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和霍乱弧菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3与B3和内引物是FIP与BIP；其中引物的序列分别为：F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。以上所述的霍乱弧菌DNA模板是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的霍乱弧菌DNA。以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL18-32mM、MgSO415-25mM、(NH4)2SO422-28mM、Tween200.3-0.6℅、Betaine1.5-3M和dNTPs3-4.5mM，其配制方法在pH为9.0条件下，将上述溶剂混合均匀获得。一种霍乱弧菌环介导等温扩增试剂盒的应用，用于快速检测样品中是否存在霍乱弧菌污染，以及对疑似霍乱弧菌进行鉴定，具体检测步骤包括：（1）LAMP引物的设计与合成（2）霍乱弧菌DNA模板的提取（3）LAMP反应体系建立（4）LAMP检测方法。以上所述的LAMP反应体系建立LAMP反应体系以25μl计，2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍乱弧菌DNA2μL超纯水补足25μL。以上所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。以上所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在35-40分钟出现扩增。本发明的实质性特点和显著进步是：1）特异性强所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。2）灵敏度高普通的PCR检测方法的灵敏度为2.05×10-1ng/μL数量级，而使用本发明检测方法，检测限约为2.05×10-2ng/μL，是普通PCR的10倍左右。3）迅速得出结果普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从细菌基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在35-40分钟间出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判定方式简便—扩增结束即可判断结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。4）不造成污染目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，但显色法只能是反应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电泳的方法进行结果判定，无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断结果的几率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性；通过电泳的方法来判读结果的方式，增加了试验成本、耗时间且容易造成实验室污染。而本发明的LAMP荧光检测方法，荧光染料是在反应前加入，不需要开盖，能有效避免气溶胶污染。此外，本发明的LAMP检测方法在结果判定上，可以直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果。5）可实时定量本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代人标准曲线方程，即可进行定量检测。附图说明图1是本发明LAMP方法特异性检测结果，其中A1、霍乱弧菌1；A2、霍乱弧菌2；A3、嗜水气单胞菌；A4、维氏气单胞菌；A5、鮰爱德华氏单胞菌；A6、哈氏孤菌；A7、创伤孤菌；A8、水对照；结果显示2株霍乱弧菌反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，5株阴性对照菌反应管和水对照反应均无扩增。图2和图3分别是本发明LAMP方法及传统PCR方法的敏感性检测结果；其中1：2.05×101ng/Μl；2：2.05×100ng/μL；3：2.05×10-1ng/μL；4：2.05×10-2ng/μL；5：2.05×10-3ng/μL；6：2.05×10-4ng/μL；7：2.05×10-5ng/μL；8：2.05×10-6ng/μL；9：2.05×10-7ng/μL。霍乱弧菌模板DNA的起始浓度为2.05×101ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结果显示LAMP法检测限约为2.05×10-2ng/μL，而PCR法检测限为2.05×10-1ng/μL。图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：右管为以霍乱弧菌基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，左管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。图5是本发明定量检测霍乱弧菌LAMP方法的标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可进行定量检测。具体实施方式1、材料的准备霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华氏单胞菌、哈氏孤菌、创伤孤菌，为广西壮族自治区兽医所分离鉴定和保存。LAMP法DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP204，细菌基因组提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0522。2、LAMP引物的设计与合成根据GenBank中的霍乱弧菌Mdh序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，其中F3、B3为霍乱弧菌PCR检测引物，其中F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；3、细菌基因组DNA提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取受试细菌的基因组DNA。4、LAMP反应体系建立按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍乱弧菌DNA2μL超纯水补足25μL。LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以试剂盒推荐的63℃做为反应温度。5、LAMP检测方法1）特异性检测分别提取霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华氏单胞菌、哈氏孤菌、创伤孤菌的基因组DNA作为LAMP反应的模板，检验LAMP方法的特异性。2）敏感性检测以提取的霍乱弧菌基因组DNA为模板，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成8个稀释度，取各稀释度2μL作为模板进行LAMP扩增和PCR扩增，对比两种检测方法的敏感性。3）荧光可视化检测根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染。实施例1LAMP检测方法的特异性结果对2株霍乱弧菌、5株阴性对照菌和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，霍乱弧菌反应管在33分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，5株阴性对照菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。实施例2LAMP检测方法的敏感性结果霍乱弧菌DNA模板起始浓度为2.05×101ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示LAMP法检测限约为2.05×10-2ng/μL，而PCR法检测限为2.05×10-1ng/μL。实施例3LAMP检测方法的荧光可视化检测结果根据浊度仪监控优化的条件，反应器加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为阴性对照，右管为以霍乱弧菌为模板的反应情况，表明建立的方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。实施例4霍乱弧菌定量标准曲线的绘制设置对照：浓度为2.05×101ng/μL、2:2.05×100ng/μL、2.05×10-1ng/μL、4:2.05×10-2ng/μL的标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.1772x-6.9253，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2=0.9924，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数2.05，即为2.05×10-yng/μL。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为35分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于-0.7233，则浓度为100.7233，再乘以基数2.05，即为该样品的浓度2.05×100.7233ng/μL，从而达到定量的效果。表1时间(min)33.938.943.950.9标准值（-LOG）-1012<110>广西壮族自治区兽医研究所<120>一种霍乱弧菌环介导等温扩增试剂盒及其应用<160>4<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1CTGAAACCTTTGTTGCCGC<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCCCATAGAAAGAGTCGCTG<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>3GGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCG<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>4TTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT当前第1页1 2 3