一种同时检测多种病原体的三重PCR检测方法与流程

本发明涉及一种生物
技术领域：
的PCR检测方法，具体是一种能同时检测金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的三重PCR检测方法。
背景技术：
：现有的国家标准《实验动物微生物学等级及监测》GB14922.2-2011中对病原体的检测方法——以传统的分离培养、生化鉴定、血清型分析和特殊鉴定实验为主。在临床实践中，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌是人畜共患病的条件致病菌，且易混合感染。传统的诊断技术如分离培养、免疫学试验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查的现状。传统方法存在过程繁琐，费时，检出率低和漏检等缺陷。为了满足大样本的多种病原体的快速检测，急需一种快速、简便、准确率高的多重PCR检测方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种同时检测多种病原体的三重PCR检测方法，其步骤简单，检测快速，准确性高，易于标准化，克服了现有技术的不足。本发明的构思是这样的。随着PCR的核酸检定技术成功在临床医学等领域的应用，建立多重PCR新技术检测成为可能。多重PCR（multiplexPolymeraseChainReaction）是在普通PCR的基础上加以改进，一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的片段的PCR技术。其可在同一PCR反应体系中同时加入多种病原体的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或不同型病原体。基于此，本发明本着一次性检测就可以检出样品中三种病原体的目标，首先从已发表的文献中筛选出具有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的保守性序列的基因及细菌通用的基因，作为PCR检测的靶点，分别合成扩增对应保守序列的特异性引物，将4对引物同时放在一个PCR反应体系中，通过各项优化，建立直接从样本中一次性检测三种病原体的三重PCR检测方法。本发明还通过检测粪便改进取材，进一步实现利用该三重PCR方法快速检测实际样品的目的。具体的，本发明采取的技术方案如下：一种同时检测多种病原体的三重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）筛选出具有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的保守性序列的基因和细菌通用的基因，作为PCR检测的靶点，分别合成扩增对应保守序列的特异性引物；（2）将4对引物同时放在一个PCR反应体系中，扩增出目的基因片段；（3）通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中，扩增金黄色葡萄球菌上游引物的序列如表1a所示，下游引物的序列如表1b所示；扩增绿脓杆菌上游引物的序列如表1c所示，下游引物的序列如表1d所示；扩增肺炎克雷伯杆菌上游引物的序列如表1e所示，下游引物的序列如表1f所示；扩增细菌通用上游引物的序列如表1g所示，下游引物的序列如表1h所示。具体见表1：表1引物序列及PCR产物名称引物序列(5’–3’)产物大小金黄色葡萄球菌aCACCTGAAACAAAGCATCCTAA153bpbTATACGCTAAGCCACGTCCAT绿脓杆菌cATGATCGTACAAATTGGTCGG600bpdGTCATGAAACCGCCAGTC肺炎克雷伯杆菌eTGGCCCGCGCCAGGGTTCGAAA368bpfGATGTCGTCATCGTTGATGCCCAG通用引物gAGAGTTTGATCCTGGCTCAG520bphGCGGCTGCTGCACG本发明中，步骤（1），由于对引物的退火温度，片段长度等要求，最终选定金黄色葡萄球菌的nuc基因、绿脓杆菌的LasI基因、肺炎克雷伯杆菌的PhoE基因，细菌通用的16SrRNA基因设计特异性引物。本发明中，步骤（2），PCR反应体系为50μl，包括：Mix25μl，引物6.5μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用上下游引物分别为1μl、1μl、1μl、0.25μl，DNA各1μl，其余无菌水补足；反应条件为：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环;72℃终延伸7min。本发明中，步骤（3），PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。本发明中，实际检测样品前先选择人工感染样本验证体系检测能力，再取待检测样本粪便，提取被检病原体的DNA，作为模板，进行三重PCR检测，全过程仅需要4h；并且通过检测粪便改进取材，进一步达到利用该三重PCR方法快速无创检测无创实际样品的目的。而常规的检测方法需要培养基接种，一般需24h长出菌落，再生化接种，此过程时间较长，并且对检测人员的技能要求高。本发明较常规方法缩短了检测时间，能进一步达到快速检测和检测标准化的目的。本发明取得如下有益效果：（1）由于反应体系中加入由16SrRNA基因设计的细菌通用引物，作为内质控，在病原菌检测中可以根据通用引物扩增条带的情况判定反应体系是否完好及评估体系中加入的模板质量。因此较常规的PCR和多重PCR检测方法，本发明的三重PCR检测方法具有快速、灵敏、简便、准确的特点，同时降低了对检测人员的要求、检测平台和检测成本，提高了检测效率。（2）该方法体系通过检测粪便改进取材，进一步达到利用该三重PCR方法快速无创检测实际样品的目的。附图说明图1是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用的三重PCR体系引物浓度的优化结果；其中：M为100bpDNALadder；金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌上下游引物各为1μl，泳道1-4：细菌通用的上下游引物分别为1μl、0.5μl、0.25μl、0.0125μl。图2是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用的三重PCR体系退火温度的优化结果；其中：M为100bpDNALadder；泳道1：56℃；泳道2：58℃；泳道3：60℃；泳道4：62℃。图3是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用的三重PCR人工感染样本的检测结果；其中：M为100bpDNALadder；泳道1：三重PCR阳性对照；泳道2：三重PCR阴性对照；泳道3、8：粪便阴性对照；泳道4、9：金黄色葡萄球菌；泳道5、10：绿脓杆菌；泳道6、11：肺炎克雷伯杆菌；泳道7、12：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌。图4是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用的三重PCR样本的检测结果；其中：M为100bpDNALadder；泳道1：三重PCR阳性对照；泳道2：三重PCR阴性对照；泳道3-12：样本的粪便。具体实施方式本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的三重PCR体系退火温度的优化（1）样品前处理将标准的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌分别在相应的培养基或培养液中培养，其中金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌培养和肺炎克雷伯杆菌培养24h，收集菌液或菌落提取相应的DNA样本。（2）细菌DNA提取本发明采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，步骤如下：将上述3种病原体菌液或菌落溶于缓冲液GA,震荡悬浮；加入20μlProteinaseK溶液，混匀，加入220μl缓冲液GB，震荡15s，70℃10min，加入220μl无水乙醇，充分震荡混匀；将溶液和沉淀都加入一个吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液；向吸附柱加500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液；向吸附柱加600μl缓冲液PW，12000rpm离心30s，弃废液；重复一次；收集沉淀，30μlTE溶解。（3）多重PCR反应体系建立在PCR反应体系中，尤其是多重PCR反应体系中，引物浓度和退火温度是关键的影响因素。本发明为了找到合适的三重PCR体系的引物浓度和退火温度，进行如下实验：引物浓度的优化：反应体系：PCR反应体系为50μl，包括：Mix25μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用上下游引物分别为1μl、1μl、1μl，细菌通用的上下游引物分别为1μl、0.5μl、0.25μl、0.0125μl，DNA各1μl，其余无菌水补足，反应条件为：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环;72℃终延伸7min。PCR产物10μl在2.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。结果如图1显示3泳道较好。退火温度的优化：PCR反应体系为50μl，包括：Mix25μl，引物6.5μl（金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用上下游引物分别为1μl、1μl、1μl、0.25μl），DNA各1μl，其余无菌水补足。反应条件仅将退火温度分别设置为56℃,58℃,60℃,62℃，其余不变。结果如图2显示3泳道较好。（4）结果PCR反应体系为50μl，包括：Mix25μl，引物6.5μl，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用上下游引物分别为1μl、1μl、1μl、0.25μl，DNA各1μl，其余无菌水补足，反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环;72℃终延伸7min。实施例2金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的三重PCR人工样本的检测（1）样品前处理取待检测动物的样本粪便。（2）细菌DNA提取同实施例1（3）多重PCR反应体系建立PCR反应体系为50μl，包括：Mix25μl，引物6.5μl，其中，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用上下游引物分别为1μl、1μl、1μl、0.25μl，DNA分别为阳性对照3μl，阴性对照0μl，样本粪便各3μl，其余无菌水补足至50μl。反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环;72℃终延伸7min。PCR产物10μl在2.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。（4）结果金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的三重PCR样本的检测结果如图3所示：1阳性对照；2阴性对照；3、8粪便的阴性对照；4、9金黄色葡萄球菌；5、10绿脓杆菌；6、11肺炎克雷伯杆菌；7、12金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌。由结果看出，该三重PCR检测体系可以分别检出金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌。实施例3金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的三重PCR样本的检测（1）样品前处理取待检测活体动物的样本粪便。（2）细菌DNA提取同实施例1（3）多重PCR反应体系建立PCR反应体系为50μl，包括：Mix25μl，引物6.5μl（金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和细菌通用上下游引物分别为1μl、1μl、1μl、0.25μl），DNA分别为阳性对照3μl，阴性对照0μl，样本粪便各3μl，其余无菌水补足至50μl。反应条件：94℃预变性5min；进入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循环，共30个循环;72℃终延伸7min。PCR产物10μl在2.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。(4)结果金黄色葡萄球菌、绿脓和肺炎克雷伯杆菌的三重PCR样本的检测结果如图4所示：1阳性对照；2阴性对照；3-12样本的粪便。阳性对照和阴性对照良好，10粪便为绿脓杆菌阳性，其余样本的检测为阴性，与传统方法的检测结果一致。10号扩增产物送测序验证为阳性。SEQUENCELISTING<110>河北意和医学检验所有限公司<120>一种含内质控能同时检测多种病原体的三重PCR检测方法<130>1<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌<400>1cacctgaaacaaagcatcctaa22<210>2<211>21<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌<400>2tatacgctaagccacgtccat21<210>3<211>21<212>DNA<213>绿脓杆菌<400>3atgatcgtacaaattggtcgg21<210>4<211>18<212>DNA<213>绿脓杆菌<400>4gtcatgaaaccgccagtc18<210>5<211>22<212>DNA<213>肺炎克雷伯杆菌<400>5tggcccg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