基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法的制作方法

本发明属于食品病害微生物检测领域，具体涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。
背景技术：
：副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，vp)是革兰氏阴性嗜盐细菌，隶属弧菌科中的弧菌属。它是近海的鱼类、虾类、蟹类、贝类等海产品中的重要的食源性致病菌之一，属人畜共患病菌，在水产品中的污染状况非常严重，是沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原菌。为确保食品安全，保护人民身体健康，欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定，如欧盟规定副溶血性弧菌不得检出，而美国规定＜1×104/g。我国已将该菌列为主要的检验或监测对象。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。自2001年以来，副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。使用传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但检测周期长、工作量大，繁琐费时。不仅如此，低水平的病原菌污染，食品加工后导致菌体的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得传统的检测方法受到了一定的限制，因此，急需一些灵敏度更高、特异性更强、简便、快捷的水产品安全检测技术，以及时发现致病微生物，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。科技创新产生了一系列新型的检测方法，如核酸分子扩增检测技术、免疫检测、生物传感等技术，为微生物、病毒的检测提供了新的手段，在食品安全检测中发挥了重要作用。免疫荧光技术(fat)、酶联免疫吸附(elisa)、分子检测技术(pcr、rflp、aflp、rapd等)已经被用来检测各种水产病原。尽管目前已有多种微生物的检测方法，但大多需要较高的实验室条件，且操作复杂、耗时，只有熟练掌握了其操作技巧的人员才能完成测试，不适合在基层推广和使用，在发展中国家及我国临床条件有限的地区应用受到限制。因此，有必要建立水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。核酸等温扩增技术(isothermalnucleicacidamplificationtechnology)可在某一特定的温度下扩大特定dna或rna片段的拷贝数。与常规pcr技术相比，在遗传相关疾病和微生物检测中，核酸等温扩增技术可通过加热模块、水浴槽等简单非专业设备完成，对仪器要求大大简化，反应时间大幅缩短，因而更能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有非常大的实际应用价值。目前利用纳米金探针作为特异dna识别的研究层出不穷。纳米金因其高的比表面积、稳定的表面物理化学性质，特别适合作为分子识别反应的界面。将大量的识别分子固定在纳米金表面，可实现一系列的反应信号放大功能。此外，由于纳米金具有独特的等离子体共振光学性质，并随粒子形貌、表面修饰物、粒子间距、溶剂介电常数变化，表现为溶液颜色的显著改变，为实现基于纳米金探针的简便、灵敏、快速可视化分析提供了理论基础，使得构建一系列的溶液内纳米传感过程成为可能。基于此，本发明将近年最新发展起来的新型的分子扩增反应(环介导等温扩增法)与具有优异的表面特性与光学性能的纳米材料(纳米金)结合起来，开发可现场快速检测副溶血性弧菌的检测方法。已有的等温分子扩增方法多依靠荧光比色检测手段，扩增时间较长，且多为有毒化学探针，本发明的方法实现了直接的可视化检测结果判定，并提高了对分子扩增反应的响应灵敏度，缩短了检测时间，摆脱了对荧光比色试剂以及荧光检测仪器的依赖性，可大幅降低检测成本，提高检测操作的安全性能。服务于水产品质量安全与疾病防控等领域，并为其他特定的病原微生物在食品质量安全与疾病防控检测手段提供技术参考。技术实现要素：本发明的目的在于针对快速简便检测副溶血性弧菌的需求，提供了一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法。具体来说，是提供一种基于纳米金与等温核酸扩增反应检测副溶血性弧菌tlh基因的试剂及其制备方法，并提供基于该试剂在快速可视化检测中的应用方法。建立了水产品中副溶血性弧菌经济、快速、准确、特异、灵敏、简便的检测诊断方法，提高医学卫生检验、疾病防控、水产品加工和进出口检验等部门的检测质量和效率。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本发明涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，所述方法包括如下步骤：s1、制备链霉亲和素标记的纳米金；s2、对样品进行采集、增菌后，提取dna；s3、以所述dna为扩增模板进行环介导等温扩增；s4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤s3扩增完成的反应溶液体系，反应后观察反应体系溶液；如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程，则代表样品中检测出了副溶血性弧菌，如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程，则代表样品中无副溶血性弧菌。优选的，步骤s1中，链霉亲和素标记的纳米金的制备包括如下步骤：a1、调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5～2.0；a2、以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液将纳米金溶液调节至ph＝7～8；a3、将链霉亲和素稀释成一系列5-40μg/ml溶液，每1ml的纳米金溶液中分别加入0.1ml，混匀静置后，加入0.1ml10％的nacl溶液，混匀静置，随着链霉亲和素的用量的增加，纳米金溶液由蓝色变为红色；选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例；a4、每10ml的经步骤a1和a2调节好的纳米金溶液中，加入所述最佳蛋白标记比例的链霉亲和素溶液，混匀后加入0.1ml10％peg20000溶液再次混匀；a5、离心分离后，将底层悬浮液用0.5mg/mlpeg20000溶液重新离心沉淀，恢复后加入0.1mg/ml叠氮化钠后冷藏保存待用。优选的，步骤s2中，所述采集、增菌具体为：以无菌操作取样品可食部分每25g，加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225ml，均质处理，制备成1∶10的样品匀液，于36℃±1℃培养，得增菌液。优选的，步骤s2中，所述提取包括：将过夜培养的增菌液混匀后静置，吸取菌悬液每5ml，加入无菌离心管中，以8000～12000r/min离心，弃去上清液，加入0.5～2mltz裂解液悬浮菌体。优选的，所述tz裂解液的配制包括：2.0％tritonx-100，2.5mg/ml的叠氮化钠，0.1mol/ltris-hc1缓冲液，ph8.0；沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min离心5min，冷冻保存待用。优选的，所述环介导等温扩增中采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物的序列如seqidno.1～seqidno.4所示；采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的探针的序列如seqidno.5、seqidno.6所示.优选的，所述环介导等温扩增体系总体积为40μl，除所述引物和探针序列外，还包括如下试剂：各2.0μmol/l的fip和bip、各0.3μmol/l的f3和b3、1μmol/llf和lb、1×恒温缓冲液(tris-hcl，20mm，ph8.8)、1.2mol/l的甜菜碱、7mmol/l的mgso4、2.0mmol/l的dntp、5u/μl的bst大片断dna聚合酶和2μldna模板。优选的，所述环介导等温扩增体系于62℃恒温水浴中反应30min，最后在85℃下5min使扩增酶失活。优选的，步骤s3还包括，以副溶血性弧菌的tlh基因标准dna模板作为阳性模板对照，以无菌水作为阴性模板对照同时进行所述环介导等温扩增。优选的，步骤s4中，每20～100μl步骤s3扩增完成的反应溶液体系中加入的所述链霉亲和素标记的纳米金为10～50μl。第二方面，本发明涉及一种用于所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法中的试剂，所述试剂为链霉亲和素标记的纳米金；所述链霉亲和素标记的纳米金的制备包括如下步骤：a1、调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5～2.0；a2、以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液将纳米金溶液调节至ph＝7～8：a3、将链霉亲和素稀释成一系列5-40μg/ml溶液，每1ml的纳米金溶液中分别加入0.1ml，混匀静置后，加入0.1ml10％的nacl溶液，混匀静置，随着链霉亲和素的用量的增加，纳米金溶液由蓝色变为红色；选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例；a4、每10ml的经步骤a1和a2调节好的纳米金溶液中，加入所述最佳蛋白标记比例的链霉亲和素溶液，混匀后加入0.1ml10％peg20000溶液再次混匀；a5、离心分离后，将底层悬浮液用0.5mg/mlpeg20000溶液重新离心沉淀，恢复后加入0.1mg/ml叠氮化钠后冷藏保存待用。第三方面，本发明涉及一种用于所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法中的针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物和探针，所述引物的序列如seqidno.1～seqidno.4所示；所述探针的序列如seqidno.5、seqidno.6所示。本发明以纳米金表面构建生物素-链霉亲和素识别过程，结合环介导等温扩增反应技术构建副溶血性弧菌的tlh基因的检测方法，进一步建立可视化纳米传感比色检测方法。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1)高灵敏度：对含tlh基因的副溶血性弧菌的检测灵敏度达到10cfu/ul；2)检测时间短：可在30min内实现分子扩增与检测过程，大大提高了检测效率；3)仪器设备简单：仅需要恒温水浴仪器。与传统pcr方法相比，免除了对复杂的温度循环与荧光检测仪器的依赖；4)操作简便，安全。模板制备可通过简单的水煮法完成，不需纯化，各反应试剂可在混合后，通过简单的冷冻干燥后稳定保存。整个检测过程不需要较严格的技术培训即可实现。且检测过程不需要接触eb等有毒核酸检测试剂，保证了操作人员的安全。附图说明图1为纳米金变色响应等温核酸扩增基因检测过程示意图；图2为实际检测结果阴性(a)与阳性(b)。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明通过设计生物素标记的tlh基因的引物，以环介导等温扩增技术快速扩增tlh基因，扩增过程产生的大量的具有生物素标记重复序列，将链霉亲和素修饰的纳米金快速聚集，并产生强烈的颜色变化效应，达到对特定基因检测的目的(检测原理见附图1)。实施例本实施例涉及一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法；具体包括如下步骤：1.纳米金的制备在烧瓶中将50ml的254μm(0.01％wt)的氯金酸溶液加热至剧烈沸腾并搅拌，将500μl的388mm的柠檬酸三钠溶液加入正在沸腾搅拌的溶液中，2min内溶液的颜色从黄色变为红色，继续沸腾搅拌15min后，停止加热，继续搅拌直至反应液回到室温，将反应液通过0.8μm的gelman滤膜过滤，得到酒红色的纳米金，通过紫外可见光谱测量其吸收峰在527nm。将制备好纳米金存储在棕色瓶中，于冰箱中在4℃条件下保存，通常在一个月内用完。2.链霉亲和素修饰的纳米金(strepavidin-aunp)。2.1.调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5-2.0之间。2.2.调节纳米金ph值。以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液将纳米金溶液调节至ph＝7-8。优选7.4。2.3.确定链霉亲和素与纳米金的最佳使用量。将链霉亲和素稀释成一系列5-40μg/ml溶液，分别取0.1ml加到1ml的纳米金溶液中，混匀静置5min后，加入0.1ml10wt％的nacl溶液，混匀静置2h，随着链霉亲和素的用量的增加，纳米金溶液由蓝色变为红色。选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例。2.4.标记链霉亲和素。于10ml的浓度与ph值调节好的纳米金溶液中，加入最佳比例的链霉亲和素溶液，混匀2-3min，加入0.1ml10wt％peg20000溶液混匀。2.5.分离。在10000×g离心力下离心30min，吸取上清液倒掉。将底层悬浮液中加入3ml含有0.5mg/mlpeg20000溶液中，重新离心沉淀，同一溶液恢复，加入0.1mg/ml叠氮化钠后冷藏保存待用。3.样品采集及增菌参考国标gb4789.7-2013取样及增菌方法。以无菌操作取样品可食部分25g，加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225ml，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min，制备成1∶10的样品匀液，于36℃±1℃培养16h。4.dna的提取制备将过夜培养的增菌液混匀后静置5min，吸取菌悬液5ml，加入10ml无菌离心管中，以8000r/min离心2min，弃去上清液，加入1mltz裂解液悬浮菌体。tz裂解液配制：2.0％tritonx-100，2.5mg/ml的叠氮化钠，0.1mol/ltris-hc1缓冲液，ph8.0。沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min离心5min，上清即为扩增模板，冷冻保存待用。5.环介导等温扩增针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物，其序列(5’-3’)如下：引物片段1(tlh-f3)：gcgcaaggttacaacatcacseqidno.1引物片段2(tlh-b3)：gcgtgacattccagaacacaseqidno.2artificialsequence引物片段3(tlh-fip)：cgcgttcacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcgaseqidno.3引物片段4(tlh-bip)：ttggacatcaaccgctcatcgtgacgctgcacactcagagseqidno.4探针：5’修饰引物片段5(tlh-lf)：tcgggcgcagaagttagc-5’biotintegseqidno.5artificialsequence5’修饰引物片段6(tlh-lb)：ctgtcgattacatgtacacccac-5’biotintegseqidno.6上述引物和探针为用于；过程对tlh基因的扩增的试剂。环介导等温扩增体系总体积为40μl，除上述引物和探针序列外，还包括如下试剂：各2.0μmol/l的fip和bip、各0.3μmol/l的f3和b3、1μmol/llf和lb、1×恒温缓冲液(tris-hcl，20mm，ph8.8)、1.2mol/l的甜菜碱、7mmol/l的mgso4、2.0mmol/l的dntp、5u/μl的bst大片断dna聚合酶和2μldna模板。进行等温扩增时，样品进行3份重复，以副溶血性弧菌的tlh基因标准dna模板以及无菌水作为阳性和阴性模板对照同时进行，以确定进行扩增方法的可靠性。上述反应体系置于62℃恒温水浴中反应30min，最后在85℃下5min使扩增酶失活，结束反应。并通过以超纯水和已知tlh基因的dna模板代替由实际样品中提取出dna模板，反应进行过程中同时设置阳性和阴性对照反应，防止扩增反应时的可能的交叉污染。6.扩增产物的检测取20μl的链霉亲和素标记的纳米金探针加入扩增完成的反应溶液体系，震摇反应2min后，由于引物片段tlh-lf、tlh-lb在扩增过程中同时插入了dna聚集体，其5’端修饰的biotin-teg对链霉亲和素标记的纳米金探针具有强烈的亲和性能，故反应体系中存在大量的dna扩增聚集体时，链霉亲和素标记的纳米金探针将结合在该dna扩增聚集体上，反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程，指示了反应体系的扩增过程，证明了样品中tlh基因的存在，检测了含有tlh基因的副溶血性弧菌。如混合溶液未发生由红向蓝的变色过程，则证明样品中无副溶血性弧菌(图2)。进行结果判定的同时，需以检测体系中阳性以及阴性对照管分别发生和不发生变色过程为前提，以保证整个检测过程进行了良好的质控。7.检测方法的特异性实验分别以过夜培养的纯的副溶血弧菌(atcc17802)、大肠杆菌(atcc25922)、金黄色葡萄球菌(atcc29213)、单增李斯特菌(atcc15313)、创伤弧菌(atcc27562)的菌悬液进行dna模板的提取。用所建立的副溶血弧菌扩增以及检测方法进行特异性试验。以无菌水代替细菌dna模板作为阴性对照。检测结果如下表1：表1菌种名称编码tlh基因检测结果副溶血弧菌atcc17802+大肠杆菌atcc25922-金黄色葡萄球菌atcc29213-单增李斯特菌atcc15313-创伤弧菌atcc27562-8.方法灵敏度将过夜培养的副溶血弧菌atcc17802菌悬液以无菌水进行10倍稀释至10-1～10-8，取各稀释度菌液100μl进行营养琼脂平板计数，于30℃培养箱中培养48h后计数，每个稀释度进行3份试验。同时，取各稀释度菌液1ml提取dna作为模板进行扩增和检测。每个稀释度进行3份试验来验证其稳定性和检测灵敏度。以无菌水代替细菌dna模板作为阴性对照，通过平板计数的结果来确定等温扩增方法最低检测限，当3份平行样品均呈阳性时的最大稀释倍数的细菌浓度作为其最低检测限。其检测结果如下表2：表2以上结果证明本方法对副溶血性弧菌的检测限在100-1000cfu/ml之间，相当于每2ul中2-20个dna模板，显示了方法的优异的检测灵敏度。9.水产品中副溶血性弧菌检测应用验证随机采集水产品市场的文蛤样品3份，经国标gb4789.7-2013和本发明建立方法检测验证均不含副溶血性弧菌作为空白样品。将过夜接种培养的副溶血弧菌(atcc17802)的菌悬液100ul分别加入3份空白样品的匀浆中，经国标gb4789.7-2013和本发明建立方法检测验证副溶血性弧菌均为阳性。从市场上采集扇贝、文蛤、牡蛎、对虾样品30个，采用本发明建立方法进行检测，同时参考国标gb4789.7-2013方法对样品进行定性鉴定。采用本发明方法检出阳性样品6个，与国标gb4789.7-2013方法检测结果一致。而且，本发明方法检测时间可由12小时以上大幅缩短1小时内，操作过程简化，耗费试剂量很少，大大减少了人力物力的消耗。以上结果很好的验证了本发明方法的应用可行性。综上所述，本发明建立了新型比色检测水产动物病原微生物的方法、提高环介导等温扩增技术的检测效率和准确性。为快速检测与鉴定水产品中病原微生物、有效及时控制和预防疾病传播、预防食用水产品中毒提供技术支持，适合在边境口岸、食品厂、基层兽医站和养殖场中进行快速检测，对有效控制水产品中病原微生物的传播和早期诊断，保证水产品质量安全意义重大，具有广阔的应用前景。该发明可望应用于水产品生产、流通和消费领域的快速检测微生物，并可望在食品质量安全检测部门用于大量样品中污染样品的快速筛选工作。sequencelisting<110>中国水产科学研究院东海水产研究所<120>基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法<130>2017<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-f3<400>1gcgcaaggttacaacatcac20<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-b3<400>2gcgtgacattccagaacaca20<210>3<211>40<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-fip<400>3cgcgttcacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcga40<210>4<211>40<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-bip<400>4ttggacatcaaccgctcatcgtgacgctgcacactcagag40<210>5<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-lf<400>5tcgggcgcagaagttagc18<210>6<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-lb<400>6ctgtcgattacatgtacacccac23当前第1页12