本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物及其应用。
背景技术：
药物引起过敏反应主要分为i型(速发型)、ii型(细胞毒型)、iii型(免疫复合物型)、iv型(迟发型)过敏反应及类过敏反应。类过敏反应的临床症状与过敏反应类似。但其反应机理与i型过敏反应并不相同。当药物进入体内后，可直接导致肥大细胞释放内容物，触发过敏反应，且临床症状严重。过敏性休克发生于极少数接受治疗剂量药物的个体，没有致敏过程，患者血清ige浓度也未见升高，但表现为典型的速发型变态反应症状，因此又被称为假药物变态反应。类过敏反应与抗原特异性免疫反应无关，在初次接触该类药物时发生，且与剂量、注射速度有一定的相关性。作为过敏主要效应器的肥大细胞，不仅可被特异性ige附着而活化导致脱颗粒，引起i型过敏，也可被炎症因子、药物等多种促分泌物质直接激活导致细胞脱颗粒，引起临床常见的类过敏反应，使患者出现皮损症状，即表现出红斑、荨麻疹、水肿等，严重者可导致哮喘、休克等症状。目前类过敏反应产生的机理尚未完全认识，可能与致敏物质直接刺激肥大细胞释放组胺，或直接由c5a、c3a、c4a等过敏毒素与肥大细胞特异性膜受体结合后介导的肥大细胞脱颗粒有关。
类过敏反应的临床表现为局部皮肤症状，如头面部、胸部及四肢的血管扩张、红斑、水肿、眼结膜充血；消化系统症状，如流涎、恶心、呕吐、腹泻、厌食；呼吸循环系统症状，如胸闷、心悸、血压升高、呼吸困难，严重的可发生呼吸循环衰竭，导致患者休克、死亡。其症状特点与药物静脉注射的速度有关，注射速度越快，组胺的释放量越大，机体反应越严重，即低剂量、低浓度，可无或仅出现轻微症状；大剂量、高浓度可诱发严重的药品不良反应。但是，机体的反应症状会随着重复给药逐渐减弱甚至自行消退，而过敏反应则不具有此特点。
类过敏反应近年来在临床中的发生频率不断升高，约占急性过敏反应的77％，在中药注射剂引起的过敏性休克中，约3/4属于类过敏反应，由于其临床危害性大，日益成为医疗工作者关注的热点。但是，目前临床上并没有监控类过敏反应的相应标准，更没有提前检测患者发生类过敏反应风险的相关研究。常规的标志物组胺、类胰蛋白酶和ige都存在各种各样的问题，并不适用于临床检测类过敏反应。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物及其应用，以解决目前患者发生类过敏反应风险筛查技术手段欠缺的问题。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物，所述基因标志物为mrgprx2受体的特征基因序列。
所述mrgprx2受体的特征基因序列如seqidno.1所示。
所述的用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物在制备药物类过敏反应敏感人群筛查产品中的应用。
所述药物类过敏反应敏感人群筛查产品包括用实时定量pcr方法筛查药物类过敏反应敏感人群的产品。
所述用实时定量pcr方法筛查药物类过敏反应敏感人群的产品包含特异性扩增mrgprx2受体的特征基因序列的引物。
所述引物包括forward引物和reverse引物，其中forward引物的序列如seqidno.2所示，reverse引物的序列如seqidno.3所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物为mrgprx2受体的特征基因序列。该基因标志物能够用于药物类过敏反应敏感人群的筛查，能够在制备药物类过敏反应敏感人群筛查产品等方面得到应用，该基因标志物可用于患者类过敏反应发生风险的筛查和诊断，具有很高的敏感性和特异性，而且由于在筛查过程中采用临床上最易采集的外周血进行检测，即用pcr扩增的方法检测外周血中mrgprx2受体特征基因序列的含量，即可评估类过敏反应发生的风险，使用方便，适于患者用药前大规模人群筛查，对促进类过敏反应易发生人群的提前发现，提高用药的安全性有重要意义，具有广阔的应用前景。
进一步的，本发明提供的用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物包含seqidno.2和seqidno.3所示的外周血mrgprx2受体的特征基因序列。本发明还提供了所述基因标志物在制备药物类过敏反应敏感人群筛查产品中的应用。药物类过敏反应敏感人群筛查产品(即筛查类过敏反应发生风险的产品)包括用实时定量pcr方法筛查药物类过敏反应敏感人群的产品。而用实时定量pcr方法筛查类过敏反应发生风险的产品包含特异性扩增外周血mrgprx2基因序列的引物，其序列如seqidno.2和seqidno.3所示。
具体实施方式
研究发现：类过敏刺激物首先激活细胞膜上的g蛋白，进而激活蛋白激酶c和ca2+通道，使内质网释放ca2+进入细胞内。伴随着细胞内ca2+浓度增加，肥大细胞和嗜碱性粒细胞内的颗粒囊泡向胞浆膜移动并释放生物介质，从而引发类过敏反应。类过敏刺激物所激活的g蛋白为mrgprs(mas-relatedgprotein-coupledreceptors)，该受体不依赖ige，可直接介导肥大细胞活化，诱导肥大细胞脱颗粒。此类受体在各种属、组织和器官的表达类型并不相同：其中mrgprx2在人源肥大细胞中表达；该受体胞外区为感应区，特异性不高，当胞外被脱颗粒多肽、p物质、compound48/80、β-防御素等多种物质激活后，胞内区信号触发，引起肥大细胞激活，释放组胺等颗粒物质，刺激细胞旁分泌，从而影响到周围细胞。mrgprx2是很多小分子药物引起类过敏、假性过敏的作用靶点。因此通过对mrgprx2基因拷贝数的分析，从而推测出mrgprx2受体在不同患者中的表达量，有助于评价患者在用药过程中发生类过敏反应的风险，对临床上指导用药的安全性具有重要意义。
本发明通过定量分析外周血总rna的基因表达状况，比较随机取样患者和发生过药物类过敏反应患者两组样本中外周血mrgprx2基因的表达差异，再通过标准曲线计算出mrgprx2基因在不同个体外周血中发生差异表达(基因表达量高于平均水平或低于平均水平)的基因信号，即外周血中mrgprx2特征性基因(生物标志物)的表达信号。采用绝对定量的方法，基于外周血mrgprx2特征基因建立患者用药发生类过敏反应风险预测的模型。最后，采用荧光定量rt-pcr定量检测受检者外周血中基因标志物的相对表达量，利用建立的患者用药发生类过敏反应风险预测模型判别受检者是否再用药后会发生类过敏反应及相应的风险概率，指导临床用药。
下面对本发明发现所述用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物的具体过程进行详细说明。
一、特征基因标志物在人群中表达量基线的确定。
具体包括以下步骤：
1)采用paxgenetmbloodrnatube采血管收集300例经检查确定为没有疾病和妊娠反应的20-80岁健康的受检者外周血样本，每个样本采集1.5-2ml外周血。
2)采用trizol提取上述外周血样本的总rna。
(1)每1ml外周血标本中加入1ml的trizol；
(2)12000rpm/min离心10分钟，取1ml上清至1.5mlep管中；
(3)加入0.2ml氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，室温放置2-3分钟，然后离心4℃，12000rpm/min，15min。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上面是无色的水相。rna只存在于水相中。水相占总trizol的60％。
(4)将上层水相转移到另一干净的ep管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10min，然后离心4℃，12000rpm/min，10min。
(5)去上清，加入0.8ml体积分数75％的乙醇洗涤rna沉淀，离心4℃，10000rpm/min，1min，重复两次。
(6)去上清，加入0.8ml无水乙醇洗涤rna沉淀，离心4℃，10000rpm/min，1min。
(7)去上清，置于真空或空气中5-10分钟，干燥rna沉淀。用无rnase水或0.5％sds溶液重悬rna沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟。
(8)测浓度：取5μl储存液加入另一个ep管中，以无rnase水作为空白对照，测od260/280值。1od＝40μgrna。od260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。
(9)rna鉴定：甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提rna完整性和dna污染情况。
3)用bio-tekepoch微孔板分光光度计检测rna样本的纯度。所有rna样本必须符合以下质控条件：rna产率大于2微克，28s/18s峰的比值大于1，rin值大于7，260nm/280nm的吸光度比值大1.8。
4)利用takara公司的primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒去除总rna中的基因组，并进行逆转录。
5)利用标准质粒进行实时荧光定量pcr检测样品循环数，并绘制标准曲线，对扩增后的样品进行拷贝数检测，并利用标准曲线求得样品的拷贝数。
其中荧光定量pcr条件如表1所示。
表1荧光定量pcr条件
其中，forward引物的序列为：5'-caggacattgctgaggtgga-3'；
reverse引物的序列为：5'-agttcagcaaatcagacagacagg-3'。
6)利用统计学方法，对300例样品进行统计学分析，计算95％置信区间以及正态分布情况。
二、特征基因标志物在过敏人群中表达量的确定。
具体包括以下步骤：
1)收集20-30例在临床上确定发生类过敏反应患者的外周血样本，每个样本采集1.5-2ml外周血。
2)按照上述“一、特征基因标志物在人群中表达量基线的确定”中的步骤，提取样品总rna并检测mrgprx2基因的拷贝数。
3)利用统计学的方法计算过敏人群基因拷贝数的95％置信区间以及正态分布情况。
4)利用统计学的方法，对比两类人群中mrgprx2基因的拷贝数，找出拷贝数的差异性。
三、结果。
1、对常规人群及过敏病人人群采集血样数目分析，结果如表2所示。
表2常规人群及过敏病人人群血样数目分析
2、序列表
mrgprx2受体的特征基因序列如seq.id.no.1所示。
引物序列如下：
seq.id.no.2：forward引物：5'-caggacattgctgaggtgga-3'；
seq.id.no.3：reverse引物：5'-agttcagcaaatcagacagacagg-3'。
3、嗜碱性粒细胞mrgprx2受体表达检测
提取全血中嗜碱性粒细胞总rna，利用rt-pcr的方法检测mrgprx2基因表达量，结果如表3显示，测得mrgprx2基因拷贝数约为(1.1±0.23)×104，说明mrgprx2受体在全血嗜碱性粒细胞上得到表达。
表3嗜碱性粒细胞基因拷贝数
此外，进行了westernblot检测以及全血免疫荧光检测分析。结果如表4所示，从表4中westernblot结果可以看出，全血中的嗜碱性粒细胞能够检测到mrgprx2受体蛋白的表达。
表4全血中mrgprx2受体蛋白含量westernblot检测
另外，免疫荧光结果显示，利用特异性的抗体cd63能够定位全血中嗜碱性粒细胞，进一步利用mrgprx2受体特异性的抗体进行标记，明确了嗜碱性粒细胞中mrgprx2受体是确实存在的。
4、嗜碱性粒细胞功能性分析
利用血液中嗜碱性粒细胞ku812细胞株进行钙成像和组胺释放的功能性实验。结果显示，mrgprx2受体特异性的激动剂，c48/80、环丙沙星、吗啡以及阿曲库铵均能激活两种细胞的钙动员，引起细胞胞内钙离子浓度的升高。同时，组胺释放表明，4种激动剂均能引起ku812细胞释放组胺，且释放量与给药剂量成正相关。
以上实验结果证明，全血中的嗜碱性粒细胞与肥大细胞在功能上具有一定的相关性，两种细胞具有一定的同源性。因此可以对全血中嗜碱性粒细胞进行检测来反映肥大细胞的受体表达情况。简单、方便、快捷的评价患者mrgprx2受体表达的差异，为临床用药的风险性进行评价。
本发明的提供的用于患者发生类过敏反应风险筛查的基因标志物，能够用于类过敏发生反应发生风险筛查，并在制备筛查早期药物类过敏反应敏感人群的产品等方面得到应用，具有敏感性高、特异性强等优点，而且由于是以临床上最易采集的外周血作为检测样本，检测方便，适用于用药患者及药物类过敏反应敏感人群的大规模人群筛查和早期诊断，应用前景广阔。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
核苷酸序列表
<110>西安交通大学
<120>一种用于药物类过敏反应敏感人群筛查的基因标志物及其应用
<160>3
<210>1
<211>6227
<212>dna
<213>mrgprx2
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