与南瓜叶黄素含量主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术及育种领域，特别涉及一种与南瓜叶黄素含量主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用。

背景技术：

叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然物质，天然的叶黄素是一种优良的抗氧化剂，能抵御游离基在人体内造成的细胞与器官损伤，从而达到预防机体衰老引发的心血管硬化、冠心病等，同时还可预防老年性眼球视网膜黄斑退化引起的势力下降和失明。

南瓜中含有丰富的类胡萝卜素，其中叶黄素的含量尤为丰富，每100g鲜品中含叶黄素0-17mg。随着科学研究的深入，社会的需求，人们越来越重视食品的营养保健作用，因此，选育高叶黄素南瓜是未来南瓜品质育种的重要目标之一。传统育种方式选育高叶黄素品种虽然可行，但耗时耗力，不利于我国的南瓜育种事业。随着高通量测序技术的成熟，特别是大量的snp(单碱基扩增多态性)标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。特别是南瓜的全基因组测序尚未完成，利用高通量测序技术开发大量的snp标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，进行南瓜叶黄素含量的基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对叶黄素含量的遗传改良具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于与南瓜叶黄素含量主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其在育种方面的应用。

本发明所采取的技术方案是：

与南瓜叶黄素含量主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，为分子标记6564或分子标记24019，其特征在于，所述分子标记定位于中国南瓜11号连锁群上，分别位于叶黄素基因两侧；其中，分子标记6564包含seqidno.1所示的核苷酸序列或其同源snp序列；分子标记24019包含seqidno.2所示的核苷酸序列或其同源snp序列。

进一步的，seqidno.1所示序列自5’端起第114位碱基是snp位点，其碱基为t或c。

进一步的，seqidno.2所示序列自5’端起第24位碱基是snp位点，其碱基为t或a。

可识别或扩增权利要求上述snp分子标记的分子探针或引物对。

进一步的，引物对为dcaps引物对。

进一步的，用于检测分子标记6564的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-tcattttgagcaccctggaa-3’(seqidno.3)，

r1：5’-ggtttagatggtccagatatccg-3’(seqidno.4)，

其对应的限制性核酸内切酶为hpy188i。

进一步的，用于检测分子标记24019的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-tcattctgctttagctttggata-3’(seqidno.5)，

r1：5’-gtcattgaatgcattggtaggag-3’(seqidno.6)，

其对应的限制性核酸内切酶为ecorv。

识别或检测上述snp分子标记的分子探针或引物对在选育高叶黄素含量辅助育种中的应用。

一种用于南瓜叶黄素含量辅助育种的试剂盒，其包括识别或扩增上述snp分子标记的分子探针或引物对。

一种南瓜辅助育种的方法，包括提取南瓜基因组dna，检测上述snp分子标记的类型，根据snp类型确定南瓜品种叶黄素含量高低。

本发明的有益效果是：

本发明对南瓜叶黄素含量的数量性状位点进行了qtl定位，并筛选得到了与南瓜叶黄素含量qtl紧密连锁的分子标记6564和分子标记24019，两标记间的遗传距离为0.553cm，定位的qtl位点对该数量性状存在显著关联关系(p<0.05)，且贡献率较高，分子标记6564的解释概率为15.2％，分子标记24019的解释概率为15.6％。通过这两个分子标记可以预测南瓜叶黄素含量的高低，为实现南瓜叶黄素含量性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。

附图说明

图1为高叶黄素含量的母本(p1)，果肉颜色为黄色，和低叶黄素含量的父本(p2)，果肉颜色为橙色；

图2为南瓜叶黄素基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示lod值；红线表示所有的lod值拟合后的结果；虚线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著；

图3为南瓜叶黄素基因所在的11号连锁群的紧密连锁区间，左边为连锁群的遗传距离(cm),右边为标记的编号，lutein为叶黄素基因所在位点；

图4为分子标记6564的pcr扩增后酶切结果：p1、p2分别为高叶黄素含量母本和低叶黄素含量父本的酶切带型，其中p1酶切完全，仅有一条114bp片段，p2不能被酶切，片段长度为137bp；f1部分酶切，存在114bp和137bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型；

图5为分子标记24019的pcr扩增后酶切结果：p1、p2分别为高叶黄素含量母本和低叶黄素含量父本的酶切带型，其中p1酶切完全，仅有一条183bp片段，p2不能被酶切，片段长度为206bp；f1部分酶切，存在183bp和206bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型。

具体实施方式

与南瓜叶黄素含量主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，为分子标记6564或分子标记24019，其特征在于，所述分子标记定位于中国南瓜11号连锁群上，分别位于叶黄素基因两侧；其中，分子标记6564包含seqidno.1所示的核苷酸序列或其同源snp序列；分子标记24019包含seqidno.2所示的核苷酸序列或其同源snp序列。

进一步的，seqidno.1所示序列自5’端起第114位碱基是snp位点，其碱基为t或c。当该snp位点在两个等位基因中只要有一个碱基为t时，与分子标记6564紧密连锁的南瓜叶黄素基因在果实中鉴定为高叶黄素含量，当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为c时，则果实为低叶黄素含量南瓜。

进一步的，seqidno.2所示序列自5’端起第24位碱基是snp位点，其碱基为t或a。当该snp位点在两个等位基因中只要有一个碱基为t时，与分子标记24019紧密连锁的南瓜叶黄素基因在果实中鉴定为高叶黄素，当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为a时，则果实为低叶黄素南瓜。

可识别或扩增权利要求上述snp分子标记的分子探针或引物对。

进一步的，引物对为dcaps引物对。

进一步的，用于检测分子标记6564的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-tcattttgagcaccctggaa-3’(seqidno.3)，

r1：5’-ggtttagatggtccagatatccg-3’(seqidno.4)，

其对应的限制性核酸内切酶为hpy188i。

进一步的，用于检测分子标记24019的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-tcattctgctttagctttggata-3’(seqidno.5)，

r1：5’-gtcattgaatgcattggtaggag-3’(seqidno.6)，

其对应的限制性核酸内切酶为ecorv。

识别或检测上述snp分子标记的分子探针或引物对在选育高叶黄素含量辅助育种中的应用。

一种用于南瓜叶黄素含量辅助育种的试剂盒，其包括识别或扩增上述snp分子标记的分子探针或引物对。

一种南瓜辅助育种的方法，包括提取南瓜基因组dna，检测上述snp分子标记的类型，根据snp类型确定南瓜品种叶黄素含量高低。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括dna提取、pcr扩增、page凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料植物材料：高叶黄素含量材料是从泰国引进分离获得的高代自交系，命名为cmo-e(p1)，而低叶黄素含量材料是广东本地获得的高代自交系，命名为cmo-x(p2)。图1为p1和p2的果肉照片，高叶黄素含量的母本(p1)，果肉颜色为黄色；而低叶黄素含量的父本(p2)，果肉颜色为橙色。cmo-e和cmo-x杂交获得f1，f1自交得f2，用作遗传分析和定位群体。

2、供试材料果实叶黄素含量的确定和遗传规律分析

将200株f2群体单株果实以及父母本粉粹，冷冻干燥后研磨，称取各样品粉末20mg，以丙酮(hplc级，bcr)作为提取液，用冷冻离心机(5417r，eppendorf)在12000r·min^-1、4℃下离心15min，获得类胡萝卜素提取液，采用高效液相色谱(hplc)测定果实叶黄素含量，结果如表1所示。

表1p1、p2、f1及30个f2群体单株果实的叶黄素含量

用excel2016处理数据，检测是否服从正态分布。

二、南瓜遗传图谱构建和叶黄素含量高低的初步定位

1、南瓜基因组dna的提取

使用ctab法提取南瓜亲本及200株f2群体基因组dna，提取的单株dna用于文库构建；

2、遗传图谱构建

本研究前期委托深圳恒创生物科技有限公司利用ddrad技术进行高通量测序，一共202个样本，采用ecroi和alnⅲ进行酶切，末端修复、添加测序接头、pcr扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测，以保证文库质量。将合格的文库，根据数据量预算，进行illuminahiseq测序。插入片段长度为500bp；测序类型为pe150；去掉用于区分样品的标签序列(4～8bp)，实际read长度为142～146bp。通过聚类比较检测出rad-tags上的snps集。

对初始snp集进行过滤，可得到较为可靠的基因型数据。共开发18314个snp标记，缺失率小于20％，选取3470个高质量snp，利用joinmap软件将lod值设为6.0构建高密度分子标记遗传图谱，图谱共分为20个连锁群，总图距3087.03cm，平均标记间图距0.89cm，最短连锁群87.30cm，最长274.47cm。

3、叶黄素基因lutein的精细定位

利用mapqtl5软件采用复合区间作图法(mqm)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的qtl，置换检验次数设为1000，qtl判断标准为：p值小于0.05时对应的lod值作为筛选的阈值，图中以虚线表示。超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，虚线的lod值为6.3，一个group代表一个连锁群，将叶黄素基因lutein精细定位在11号连锁群(图2)，定位在两个snp标记6564和24019之间，区间从86.709cm到87.262cm(图3)，其中snp标记6564包括序列：

tcattttgagcaccctggaacaagagagaaaataaggccataaaaaacaaagtttaagttggggtgctcaagcaagaaaatataaaatgcaaatatctattactcactgcgtattggatatctggaccatctaaacc(seqidno:1)，其中下划线标记的t具有t→c的变化(即自5’端起第114位碱基是snp位点，其碱基为t或c)。

snp标记24019包括序列：

tcattctgctttagctttggacgtcctggtggtcttctagtaggtggaggggttactgtgactagtgccgtagtcgattcatccaggattagtctgtccacatttgggacaggatggattgattccgcgtatgttaggcggtaactctcgactgtgaaatatctggggcaataatcatatgggctcctaccaatgcattcaatgac(seqidno:2)，其中下划线标记的t具有t→a的变化(即自5’端起第24位碱基是snp位点，其碱基为t或a)。

三、dcaps分子标记开发、扩增、酶切验证

根据分子标记6564和分子标记24019的snps标记信息，使用dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和genetool分别设计衍生的酶切多态性扩增序列(dcaps)引物的错配引物和另一侧的引物，完成从snps向dcaps标记的转化。6564的错配碱基数为1个，24019的错配碱基数为2个。

用于扩增分子标记6564的引物序列如下所示：

f1：5’-tcattttgagcaccctggaa-3’(seqidno.3)；

r1：5’-ggtttagatggtccagatatccg-3’(seqidno.4)；

当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为t时，pcr产物可被限制性核酸内切酶hpy188i识别并切割，产生114bp的片段，可以判断与分子标记6564紧密连锁的南瓜叶黄素在果实中为高含量叶黄素；当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为c时，pcr产物不能被限制性核酸内切酶hpy188i识别并切割，只有137bp的片段，可以判断南瓜果实为低叶黄素南瓜；当该snp位点在两个等位基因中的碱基一个为t一个为c时，则存在114bp和137bp的片段，南瓜果实含有高叶黄素。

用于扩增分子标记24019的引物序列如下所示：

f1：5’-tcattctgctttagctttggata-3’(seqidno.5)，

r1：5’-gtcattgaatgcattggtaggag-3’(seqidno.6)，

当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为t时，pcr产物可被限制性核酸内切酶ecorv识别并切割，产生183bp的片段，可以判断与分子标记24019紧密连锁的南瓜叶黄素在果实中为高含量叶黄素；当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为a时，pcr产物不能被限制性核酸内切酶ecorv识别并切割，只有206bp的片段，可以判断南瓜果实为低叶黄素南瓜；当该snp位点在两个等位基因中的碱基一个为t一个为a时，则存在183bp和206bp的片段，南瓜果实含有高叶黄素。

pcr扩增体系使用20μl的扩增体系，包含1utaq酶，1μl模板dna，1μl的dntp，1.5μl引物，2μl的10×pcrbuffer，加ddh2o至20μl。pcr扩增程序为：94℃3min，循环过程为94℃30s、退火30s、72℃1min、30个循环，最后72℃延伸10min。6564引物的退火温度为55℃，24019的退火温度为53℃。

在两亲本间进行pcr扩增，分别经过限制性内切酶hpy188i和ecorv进行酶切后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图4和图5)。

实验数据表明亲本间表现特异，母本与父本的叶黄素含量比值为3，鉴定f2群体单株30个，两个标记的结果一致，且果实叶黄素含量与双酶切结果一致，上述两个snp标记可以将高含量叶黄素和低含量叶黄素区分开。

使用其他公知的方法对分子标记6564和分子标记24019进行检测，确定其snp情况，也可以达到相同的目的。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院蔬菜研究所

<120>与南瓜叶黄素含量主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用

<130>qtl

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>137

<212>dna

<213>南瓜

<220>

<221>allele

<222>(114)..(114)

<223>snp位点，突变碱基为c

<400>1

tcattttgagcaccctggaacaagagagaaaataaggccataaaaaacaaagtttaagtt60

ggggtgctcaagcaagaaaatataaaatgcaaatatctattactcactgcgtattggata120

tctggaccatctaaacc137

<210>2

<211>206

<212>dna

<213>南瓜

<220>

<221>allele

<222>(114)..(114)

<223>snp位点，突变碱基为c

<400>2

tcattctgctttagctttggacgtcctggtggtcttctagtaggtggaggggttactgtg60

actagtgccgtagtcgattcatccaggattagtctgtccacatttgggacaggatggatt120

gattccgcgtatgttaggcggtaactctcgactgtgaaatatctggggcaataatcatat180

gggctcctaccaatgcattcaatgac206

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工引物

<400>3

tcattttgagcaccctggaa20

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工引物

<400>4

ggtttagatggtccagatatccg23

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工引物

<400>5

tcattctgctttagctttggata23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工引物

<400>6

gtcattgaatgcattggtaggag23