用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药，可抑制血小板活化、聚集，防止血栓形成，在心脑血管病的一、二级防治中，起着至关重要的作用。然而，临床发现部分长期服用阿司匹林的患者，心脑血管事件的发生率并未降低，即可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗(aspirinresistance，ar)现象。有研究报道5％-40％的人存在阿司匹林抵抗。

阿司匹林(aspirin)可与cox活性部分丝氨酸残基发生不可逆的乙酰化反应，使cox失活，抑制血小板功能。cox-1启动子区的snpcox1(-1676a>g)位点多态性会影响cox-1的表达，使阿司匹林可能对血小板cox不能完全抑制，从而存在一定程度的阿司匹林抵抗。在一项对老年心脑血管病患者发生阿司匹林抵抗的研究中，研究者首次发现cox-1基因-1676a>g位点(rs1330344)的多态性可能与中国汉族人群ar的发病相关。

血小板表面主要有gpⅰa/ⅱa、gpⅵ、gpⅳ三种胶原受体。gpⅰa/ⅱa位于连接血小板与胶原纤维(ⅰ、ⅱ型)或非胶原纤维(ⅲ、ⅳ型)的二价阳离子键之间。gpia基因位于第5号染色体上，它的snp常常会改变血小板膜胶原受体的密度，使血小板的聚集、血栓形成发生改变，影响阿司匹林的疗效。807c>t和873g>a已被证实与血小板表面受体不同的表达有关。基因型807tt(873aa)与受体的高密度表达有关，而807cc(873gg)则与低密度表达有关，杂合子则与中间受体表达的水平有关。santoso等研究发现携带rs1126643t等位基因，血小板表面的gpⅰa/ⅱa的密度增加4倍，血小板活性显著增加，血小板聚集加强。苏冠华等对200例服用阿司匹林进行心脑血管病预防的中国汉族高危人群进行分析，结果显示ar和asr组t等位基因频率均显著高于as组(χ2＝12.848，p<0.005)；ar组与asr组的tc和tt基因型频率也均高于as组(p<0.05)。logistic回归分析提示，血小板膜蛋白rs1126643t等位基因与ar的发生显著相关(or3.76，95％ci：2.87～9.58，p<0.05)。

因此临床上在对病人进行药物治疗时需首先对与阿司匹林个体化用药相关的基因位点基因进行检测，再判断是否服用阿司匹林进行进行治疗，使治疗更加具体而精准，也可避免延误患者的治疗，减少资源浪费。

目前常用的检测基因多态性的方法有dna直接测序法、限制性片段长度多态性分析法(pcr－pflp)、高分辨率溶解曲线(hrm)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量pcr法等。测序技术是公认的检测基因突变的金标准，但其设备成本高、检测周期长、检测通量低、检测灵敏度低、对实验人员的技术操作要求高、结果判定步骤繁琐等原因，较难形成商业化的诊断产品；限制性片段长度多态性分析法检测灵敏度同样不高、操作步骤繁琐，检测的结果仍需要进行一代测序法的再次验证，尤其当样本量多时极易造成pcr产物的交叉污染容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，因此也无法应用到临床上。芯片检测因其检测结果的准确性和重复性较差，实验周期长等缺点，也不适于开发临床检测试剂盒。荧光定量pcr的检测方法拥有成本低、灵敏度高、特异性好，结果的重复性好等优点。

技术实现要素：

为了解决存在阿司匹林抵抗的患者不建议采用阿司匹林药物进行心脑血管病治疗的技术问题，本发明从基因层面出发，提供一种指导阿司匹林个体化用药关基因多态性检测的引物组、试剂盒及其方法，具有检测快速、准确性高、灵敏度高及特异性好的优点。

本发明提供一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组，其特征在于，包括针对gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)基因多态性检测的特异性引物及探针，如下：

gpia(807c>t)正向引物：

5’-caacatcccagacatcccaat-3’；

gpia(807c>t)反向引物：

5’-cctattagcaccaaaacttaccttgc-3’；

gpia(873g>a)正向引物：

5’-catgtgattcaccgtcagttacaa-3’；

gpia(873g>a)反向引物：

5’-tatctgccacagaaaatatgcttattc-3’；

cox1(-1676a>g)正向引物：

5’-cacccatctgcactcaaaaca-3’；

cox1(-1676a>g)反向引物：

5’-tctgattctgaggtgaaggctctt-3’；

gpia(807c>t)野生型探针：

5’vic-tcacaaacacatttgga-mgb3’；

gpia(807c>t)突变型探针：

5’fam-caaacacattcggagca-mgb3’；

gpia(873g>a)野生型探针：

5’vic-taccattactttcgtagcac-mgb3’；

gpia(873g>a)突变型探针：

5’fam-cattacttttgtagcactt-mgb3’；

cox1(-1676a>g)野生型探针：

5’fam-cctggcactaatg-mgb3’；

cox1(-1676a>g)突变型探针：

5’vic-cctggcactgatgg-mgb3’。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，包括含有上文所述的特异性引物及探针的三种pcr反应液，所述pcr反应液分别为gpia(807c>t)pcr反应液、gpia(873g>a)pcr反应液及cox1(-1676a>g)pcr反应液，其中，

gpia(807c>t)pcr反应液包括:

gpia(807c>t)正向引物、gpia(807c>t)反向引物、gpia(807c>t)野生型探针及gpia(807c>t)突变型探针；

gpia(873g>a)pcr反应液包括:

gpia(873g>a)正向引物、gpia(873g>a)反向引物、gpia(873g>a)野生型探针及gpia(873g>a)突变型探针；

cox1(-1676a>g)pcr反应液包括:

cox1(-1676a>g)正向引物、cox1(-1676a>g)反向引物、cox1(-1676a>g)野生型探针及cox1(-1676a>g)突变型探针；

上述pcr反应液均还包括pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及无核酸酶水。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述pcr反应液的成分终浓度为：1×pcrbuffer，0.1～0.3μm的各特异性引物及探针、0.2～0.3mm的dntps、1u的hs-taq酶。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；

所述阳性对照品一为gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点10⁵野生型质粒混合物；

所述阳性对照品二为gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的10⁵杂合型质粒混合物；

所述阳性对照品三为gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点10⁵突变型质粒混合物。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。

本发明还提供一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因的检测方法，包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的dna，作为pcr模板；

步骤二：提供如上文所述的试剂盒，取出适量pcr反应液，将所述pcr反应液与适量所述pcr模板混匀；

步骤三：进行pcr扩增反应：25℃ung酶处理，95℃变性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec；

步骤四：pcr结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到ct值进行结果判定，得到阿司匹林个体化用药相关基因的基因型。

相较于现有技术，本发明提供的用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及taqman-mgb荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，实现从基因层面指导阿司匹林个体化用药，使得治疗更加精确且可减少医疗资源的浪费；此外再配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的pcr反应体系，使得本发明具有操作简单、检测快速、准确性高、灵敏度高及特异性好的优点。

附图说明

图1为临床样本gpia(807c>t)野生型的pcr扩增曲线图；

图2为临床样本gpia(807c>t)杂合型的pcr扩增曲线图；

图3为临床样本gpia(807c>t)突变型的pcr扩增曲线图；

图4为临床样本gpia(873g>a)野生型的pcr扩增曲线图；

图5为临床样本gpia(873g>a)杂合型的pcr扩增曲线图；

图6为临床样本gpia(873g>a)突变型的pcr扩增曲线图；

图7为临床样本cox1(-1676a>g)野生型的pcr扩增曲线图；

图8为临床样本cox1(-1676a>g)杂合型的pcr扩增曲线图；

图9为临床样本cox1(-1676a>g)突变型的pcr扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、引物和探针的设计与合成

针对人基因组中gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)基因位点(序列参见ncbi数据库公开的人类全基因组序列)，使用primerpremier3.0及methylprimerexpressv1.0软件，分别设计特异性引物及mgb标记的探针。特异性引物和mgb标记的探针由上海invitrogen有限公司合成。

特异性引物及探针序列，如表一所示：

表一、特异性引物及探针序列表

二、对照品选择

阳性对照品一为gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点10⁵野生型质粒混合物；

阳性对照品二为gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的10⁵杂合型质粒混合物；

阳性对照品三为gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个基因位点10⁵突变型质粒混合物；

空白对照品为无核酸酶水。

三、pcr反应液组成

包括含有上述特异性引物及探针的三种pcr反应液，所述pcr反应液分别为gpia(807c>t)pcr反应液、gpia(873g>a)pcr反应液及cox1(-1676a>g)pcr反应液，其中，

gpia(807c>t)pcr反应液包括:

gpia(807c>t)正向引物、gpia(807c>t)反向引物、gpia(807c>t)野生型探针及gpia(807c>t)突变型探针；

gpia(873g>a)pcr反应液包括:

gpia(873g>a)正向引物、gpia(873g>a)反向引物、gpia(873g>a)野生型探针及gpia(873g>a)突变型探针；

cox1(-1676a>g)pcr反应液包括:

cox1(-1676a>g)正向引物、cox1(-1676a>g)反向引物、cox1(-1676a>g)野生型探针及cox1(-1676a>g)突变型探针；

上述pcr反应液均还包括pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及无核酸酶水；

其中，所述10×pcrbuffer、dntp及无核酸酶水均购自大连宝生物(宝生物(大连)工程有限公司)；所述无核酸酶水为(nuclease-freewater)用depc(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水；hs-taq酶(takarataqhotstartversion，购自大连宝生物)是针对普通taqdna聚合酶灵敏度高，易产生非特异性条带的情况，专门研制的高特异性嗜热dna聚合酶产品，。

所述pcr反应液成分的终浓度为：

1×pcrbuffer

0.1～0.3μm的各特异性引物及探针

0.2～0.3mm(mmol/l)的dntps

1u的hs-taq酶

无核酸酶水适量(将体系补充至18.5ul)。

实施例2：利用上述试剂盒对用于指导阿司匹林个体化用药相关基因型进行检测：

一、生物样本

本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。为2016年6-12月期间在湘雅医学检验所检测的500例剩余人群抗凝血。

二、取待检测样本抽提的dna，作为pcr模板：

dna提取试剂盒为自主研发的提取试剂盒《核酸提取或纯化试剂》进行提取(备案号：湘长械备20150166)。

1)取无菌的1.5mlep管，加入250ul全血；

2)加750ul细胞裂解液，颠倒混匀5-6次，室温静置10min；

3)12000rpm离心1.5min；倒掉上部废液，收集管底沉淀；

4)依次加入20ul蛋白酶k、250ul裂解液abl，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次；

5)取出，加入250ul无水乙醇，涡旋振荡10s，短暂离心5s；

6)将吸附柱插入收集管中，将上一步所得混合液转移至吸附柱中；10,000rpm离心1min；

7)弃收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500ul洗液i，10,000rpm，1min离心；

8)弃收集管中废液，加入700ul洗液ii，10,000rpm，1min，离心。弃废液；(洗液ii使用前需加入无水乙醇至80％)

9)重复步骤8一次；

10)弃流出液，将吸附柱插回收集管，空转离心，13,000rpm，2min；

11)将吸附柱插入到新的ep管中；加入30-100uldna溶解液(65℃预热可提高dna获得率)，室温静置5min；

12)10,000rpm，1min，离心，弃吸附柱，ep管内液体即为dna溶液。2-8℃保存，若需长期保存请置于-20℃或更低温度。

三、提供所述试剂盒，取出适量pcr反应液，将所述pcr反应液与适量所述pcr模板混匀：

从试剂盒中取出所需数量pcr反应液8连管(每检测位点的pcr管数＝样本数+1个空白对照+3个阳性对照)；

pcr反应液室温融解后，瞬时离心，揭开管盖；

从待检样本dna(或对照品)中取1.5μl加至pcr反应液中；

振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。

四、进行pcr扩增反应：25℃ung酶处理10min；95℃变性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec。

使用的pcr仪器为abi7500或杭州博日fqd-96a荧光定量聚合酶链式反应(pcr)检测系统，反应体系为20ul；

pcr反应条件如表二所示：

表二、pcr扩增反应条件

五、pcr结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到ct值进行结果判定，得到用于指导高血压个体化用用药相关基因的基因型。

结果有效性判定，如表三所示：

表三

空白对照结果为阴性(noct或ct值≥38)。

pcr结果判定，如表四所示：

表四、结果判定表

根据荧光定量pcr中的结果判定表得出gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g)三个位点的基因型。

基于本发明的临床样本各基因位点检测结果，参见图1-图9，其中，图1为临床样本gpia(807c>t)野生型的pcr扩增曲线图，图2为临床样本gpia(807c>t)杂合型的pcr扩增曲线图，图3为临床样本gpia(807c>t)突变型的pcr扩增曲线图，图4为临床样本gpia(873g>a)野生型的pcr扩增曲线图，图5为临床样本gpia(873g>a)杂合型的pcr扩增曲线图，图6为临床样本gpia(873g>a)突变型的pcr扩增曲线图，图7为临床样本cox1(-1676a>g)野生型的pcr扩增曲线图，图8为临床样本cox1(-1676a>g)杂合型的pcr扩增曲线图；图9为临床样本cox1(-1676a>g)突变型的pcr扩增曲线图。

实施例三对阿司匹林精准用药指导

通过多方面的研究分析，本明通过三个位点(包括gpia(807c>t)、gpia(873g>a)及cox1(-1676a>g))的检测和分析，可指导阿司匹林的精准用药。三个位点的基因型与阿司匹林的关系对应表详见表四如示：

表四

本发明提供的用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及taqman-mgb荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，实现从基因层面指导阿司匹林个体化用药，使得治疗更加精确且可减少医疗资源的浪费；此外再配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的pcr反应体系，使得本发明具有操作简单、检测快速、准确性高、灵敏度高及特异性好的优点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

sequencelisting

<110>韩林志

<120>用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法

<130>2017

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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cctggcactgatgg14