本发明属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种乳粉中大肠菌群标准样品及其制备方法。
背景技术：
乳粉微生物学检验领域非常特殊。目前，国内外尚未有机构制备乳粉微生物学标准样品和大规模生产的先例，仍属空白领域。目前虽有一些机构制备食品中微生物标准样品，但其均匀性和稳定性几乎不能满足要求，运输极为困难；或标准样品为仅含有目标菌的纯菌株，与实际样品差距较大，不能满足日常实验室质量控制等需要。
大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化特征及血清学方面并非完全一致，其定义为：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等。如果制备的大肠菌群样品中，目标菌群易发生变化(繁殖和死亡等)，就会导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性差。因此，综合考虑细菌的生化特性，选取性质相对稳定的菌作为目标菌群对保证样品的均匀性和稳定性十分重要。大肠菌群样品制备的工艺技术要求比较高，并且样品的均匀性和稳定性与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。
乳粉中大肠菌群指标，直接反映着乳粉的卫生质量与潜在致病风险。如果大肠菌群数超过一定限量，就加大了致病性大肠埃希氏菌的存在风险，并最终导致食源性疾病发生。因此，制备均匀性与稳定性俱佳的大肠菌群样品，可以避免大肠菌群检验的随意性和不确定性，真实地反映检测实验室的能力。这对提高实验室质量控制水平，保障乳粉安全，甚至于打破国际贸易壁垒、提高我国乳粉国际竞争力都具有特殊重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是克服大肠菌群测定样品中总的活的细菌数目在运输、储存和测试等过程中菌落数都可发生变化的问题，提供一种乳粉中大肠菌群标准样品，均匀性、稳定性符合能力验证要求，本发明的另一个目的是提供该样品的制备方法，工艺简单，成功率高。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：乳粉中大肠菌群标准样品，其特征是：包括目标菌群和背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)组成，所述背景菌群由金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)、马红球菌(rhodococcusequi)组成。
所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、脱脂奶粉体积分数为15％。
所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103cfu/ml，背景菌群的目标浓度为103cfu/ml。
一种乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：
(1)菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；
(2)增菌
目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10ml的冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；
(3)菌悬液配制
将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌群的目标浓度102～103cfu/ml和背景菌群的目标浓度103cfu/ml配制菌悬液，分别配制4个目标菌的菌悬液和3个背景菌的菌悬液，分别按1:1体积比混合形成目标菌群悬液和背景菌群悬液，再将目标菌群悬液与背景菌群悬液按1:1体积比混合，得到混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；
(4)冻干和包装
将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；
(5)储存
将样品放置在4℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给参试实验室或进行均匀性和稳定性试验。
所述冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖10％、脱脂奶粉15％。
所述样品的均匀性和稳定性试验按照cnas—gl03《标准样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
本发明菌种的选择采用大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌作为大肠菌群样品的目标菌群，以金黄色葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌作为背景菌群。众所周知，大肠菌群是一类在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群中的大肠埃希氏菌比较常见，但非常容易受到环境因素(特别是温度)的影响。相比而言，以大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌作为目标菌群，可以最大程度保证测试样品的稳定性，即使在运输及储存中大肠埃希氏菌的含量发生变化，在统计学意义上也不会影响大肠菌群的总量。
本发明的大肠菌群标准样品具有以下优势特性：活的微生物、数量不发生变化、生化特征不发生变异，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品制备技术，适合于乳粉中大肠菌群标准样品的制备。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1
乳粉中大肠菌群标准样品，包括目标菌群和背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)组成，所述背景菌群由金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)、马红球菌(rhodococcusequi)组成。
所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、脱脂奶粉体积分数为15％。
所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103cfu/ml，背景菌群的目标浓度为103cfu/ml。
实施例2
如图1所示，一种实施例1中乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法，包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，具体步骤如下：
1、样品添加菌株的选择
按照主导菌群：大肠埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)，背景菌群：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)、马红球菌(rhodococcusequi)选择标准菌株，所有标准菌株均购于政府指定的机构，并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性。
2、冻干保护剂的配制
样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质(体积分数：海藻糖10％，脱脂奶粉15％)配制冻干保护剂。
3、样品冻干
(1)菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；
(2)增菌
目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10ml的冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；
(3)菌悬液配制
将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌群的目标浓度102～103cfu/ml和背景菌群的目标浓度103cfu/ml配制菌悬液。为保证得到的最终样品中含有以上目标浓度的菌株，本实施例中按照目标菌103cfu/ml分别配制4个目标菌的菌悬液，按1:1体积比混合，形成目标菌群悬液；背景菌按104cfu/ml配制3个背景菌的菌悬液，按1:1体积比混合，形成背景菌群悬液；背景菌群悬液与目标菌群悬液按1:1体积比混合，得到混合菌悬液，采用比浊法检查菌株含量；置于磁力搅拌器上不断搅拌下取1.0ml分装到样品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；
(4)冻干和包装
将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数按如下设置：
冷冻速度(coolingrate)0.5℃/min
早期冷冻点(incipientfreezingpoint)-1℃15min
冷冻温度(coolingtemperature)-40℃
共熔点(meltingpointeutectictemperature)-29℃
加热温度(heatingtemperature)20℃120min
启动冷冻干燥机，机器直接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程40h。
当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器。剔除塞子不紧的西林瓶，西林瓶中样品为真空状态；
(5)储存
将样品放置在-18℃条件下避光保存，并对保存的样品进行适当管理和检测，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。
4、样品的均匀性和稳定性试验
对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均匀性和稳定性按照gb/t15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：
分别随机选取12个样品，采用sn/t1896-2007大肠菌群测试方法，在重复条件测试2×12份样品的大肠菌群。结果数据用方差分析法进行统计处理，统计步骤及结果如下：
表1方差分析公式
上表中，
表2样品均匀性检测结果
表3样品均匀性试验方差分析结果
结论：在95％置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性是可接受的。
采用两种类型的稳定性试验：一种是在贮存温度(4℃)下的稳定性试验，另一种是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度点，分别为20℃、36℃和45℃。定期检测样品，针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本，将2×3份样品结果的均值(对数转化后)用方差分析法进行统计处理，f值<f临界值，则说明标准样品的稳定性符合要求，同时确定在不同温度条件下符合标准样品要求的最长保存时间。稳定性试验结果见表4和表5。
表4样品短期稳定性检测结果
表5样品短期稳定性试验方差分析结果
实施例3
本实施例中所述的乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法的各步骤均与实施例2中相同，不同的技术参数为：菌悬液配制中，目标菌群悬液中各目标菌的浓度按照5×103cfu/ml配制，背景菌群悬液中各背景菌的浓度按照103cfu/ml配制；冻干过程45h。
实施例4
本实施例中所述的乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法的各步骤均与实施例3中相同，不同的技术参数为：菌悬液配制中，目标菌群悬液中各目标菌的浓度按照4.5×103cfu/ml配制；冻干过程50h。