一种李斯特菌增菌培养基及制备方法与流程

本发明公开了一种选择性增菌培养基，属于微生物学领域。

背景技术：

李斯特菌是一类兼性细胞内生长的革兰阳性菌。目前李斯特菌属共有17个种，其中致病性的李斯特菌有单增李斯特菌和伊氏李斯特菌，能引起人和动物的李斯特菌病，是重要的食源性人兽共患病原菌。临床表现为人和动物的脑膜炎、败血症及孕妇流产、发热性胃肠炎等，临床死亡率较高。该菌广泛存在于土壤、肉制品及水产品等中，能在高盐、低温、干燥等各种条件下生存，主要通过污染的食品传播。20世纪80年代以来，单增李斯特菌在欧美国家多次暴发流行；我国各地食品监测结果显示单增李斯特菌污染在食品中普遍存在，并曾在云南、福建、浙江等省引起禽畜间的感染暴发。

关于致病性李斯特菌的诊断，已经建立了许多方法。其中分离培养鉴定的方法仍是诊断的金标准。目前应用较多的分离培养方法是欧洲标准化委员会(eniso)的方法以及美国食品与药品管理局(fda)的方法，中国也有自己的李斯特菌分离培养方法。这些方法可以对食品中含量较少的致病性李斯特菌进行增菌富集，使其达到可检测的水平，从而对食品中的李斯特菌进行分离检测以及后续实验。

虽然eniso的分离方法可以将样品中较低量的致病性李斯特菌进行分离培养检测，但是非致病性李斯特菌和其他环境细菌也会存在于样品中。由于非致病性李斯特菌以及其他环境细菌对增菌培养基有更好的适应性，在增菌培养基增菌培养的过程中，非致病性李斯特菌以及其他环境细菌的过快生长会掩盖致病性李斯特菌的存在，从而造成假阴性检测结果，会对人类健康造成严重隐患。另外目前分离培养李斯特菌的方法都需要两步增菌过程，非常繁琐费时。因此，本发明的目的就是提供一种李斯特菌增菌培养基，与目前广泛应用的增菌培养基相比，拥有更有效的选择性，更高的灵敏度，更简单的培养分离步骤以及更短的培养分离时间。

技术实现要素：

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种用于致病性李斯特菌选择性分离的培养基，其特征在于，所述培养基含有β-d-阿洛糖。

在一个优选的技术方案中，所述培养基还含有胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠、磷酸氢二钠。

在一个更为优选的技术方案中，所述组分以如下的质量体积千分比的配比溶于水中：

在一个尤为优选的技术方案中，所述培养基的ph值为7.1～7.3。

在一个最为优选的技术方案中，所述组分以质量体积千分比的配比为：

优选地，上述培养基还含有添加剂：盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和氯化锂。

在一个优选的技术方案中，在所述培养基中，盐酸吖啶黄的浓度为9.375mg/l，萘啶酮酸的浓度为7.5mg/l，氯化锂的浓度为2.25g/l。

其次，本发明还提供了一种用于致病性李斯特菌选择性分离的培养基的配制方法，所述方法包括以下步骤:

(1)按以下质量体积千分比的配比将各组分溶于水中：

(2)调节ph值为7.1～7.3；

(3)高压灭菌。在一个优选的技术方案中，在步骤(1)中，所述培养基还含有添加剂：盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和氯化锂。

在一个更为优选的技术方案中，在步骤(1)中，所述培养基中的盐酸吖啶黄的浓度为9.375mg/l，萘啶酮酸的浓度为7.5mg/l，氯化锂的浓度为2.25g/l。

本发明的有益效果在于：由于本发明的新型李斯特菌增菌培养基采用含有β-d-阿洛糖的基础培养基和浓度较低的添加剂，与传统培养基相比添加剂浓度降低25％，如此添加剂对致病性李斯特菌的损伤作用减小，有利于致病性李斯特菌在增菌培养过程中生长。与传统的增菌培养基相比，本发明提供的培养基在分离致病性李斯特菌时灵敏度提高了16％，并且减少了一次培养步骤，缩短了48小时的培养时间。

附图说明

图1.三种细菌利用阿洛糖的biolog表型芯片检测结果图；

图2.三种细菌在阿洛糖基础培养基中的生长速率曲线图；

图3.三种细菌在阿洛糖基础培养基中培养24小时后浓度目测图；

图4.伊氏李斯特菌(pam)与无害李斯特菌(lin)在含添加剂的新型增菌培养基中生长状况对比柱状图；

图5.三种细菌在含添加剂的新型增菌培养基与传统增菌培养基中的生长状况对比柱状图；

图6.含添加剂的新型增菌培养基增菌后单增李斯特菌的分离结果；

图7.传统增菌培养基增菌后单增李斯特菌的分离结果

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.致病性李斯特菌和无害李斯特菌对生化底物的利用比较

1.菌株

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)，伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)。

2.试剂

biolog实验所需试剂，包括氯化镁、氯化钙、精氨酸、谷氨酸、左旋胱氨酸、5’-尿苷酸钠、酵母提取物、吐温-80、双蒸水、biolog显色染料dyemix-f。

3.培养基配制

将氯化镁、氯化钙、精氨酸、谷氨酸、左旋胱氨酸、5’-尿苷酸钠、酵母提取物、吐温-80、双蒸水按照biolog提供的操作程序制备成添加剂，然后将添加剂与biolog公司提供的培养液if-0agn/gp，显色染料dyemix-f混合，制备出用于biolog实验的培养基。

4.细菌培养

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)、无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)、伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)分别在脑心培养基上培养24小时，然后挑取菌落在生理盐水中稀释到特定浓度。

5.biolog表型芯片检测

利用biolog表型芯片(美国biolog公司)观察致病性李斯特菌(单增李斯特菌和伊氏李斯特菌)与无害李斯特菌(非致病)对阿洛糖利用的差异。将等量的单增李斯特菌、伊氏李斯特菌、无害李斯特菌的菌悬液分别接种到biolog表型芯片(pm2a)上，37℃培养48小时，利用genⅲomnilog(美国biolog公司)读取三种菌对表型芯片上各种物质利用的差异。

结果如图1所示，面积代表致病性李斯特菌与无害李斯特菌对表型芯片中底物的利用情况，深色代表致病性李斯特菌与无害李斯特菌对底物利用的差异情况，浅色代表致病性李斯特菌与无害李斯特菌对底物的共同利用情况。箭头处的阿洛糖，致病性李斯特菌可以利用，而无害李斯特菌不可以利用。

实施例1显示能否利用β-d-阿洛糖是致病性李斯特菌与无害李斯特菌的一个重要生化特性，因此本发明设计含有β-d-阿洛糖的增菌培养基，并将其用于致病性李斯特菌的选择性分离和培养。

β-d-阿洛糖，中文名称为β-d-阿洛糖，英文名称：beta-d-allose，英文别名：d-allose，d-allopyranose，beta-d-allopyranose，cas：2595-97-3，einecs：219-994-4，分子式：c6h12o6，分子量：180.1559，相对密度：1.732g/cm3，沸点：410.8℃(760mmhg)，闪点：202.2℃，蒸汽压：1.83e-08mmhg(25)℃，分子式为：

实施例2.基础增菌培养基的设计和配制

根据实施例1的实验结果，将β-d-阿洛糖作为培养基的碳水化合物，并添加其他营养和化学成分基础上，设计如下的基础培养基配方并进行配制：

以上组分溶于1000ml蒸馏水，调节ph值到7.2，混匀后121℃灭菌15min，冷却后放于4℃备用。

实施例3.基础增菌培养基中细菌的生长速率对比

1.菌株

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)，伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)。

2.试剂

同实施例2。

3.培养基配制

按照实施例2配制。

4.细菌培养

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)、无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)、伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)在液体脑心培养基中培养至od＝0.6，然后用磷酸盐缓冲液(pbs)倍比稀释至特定浓度。

5.生长速率测定

分别接种等量的单增李斯特菌、伊氏李斯特菌、无害李斯特菌到三个含有5ml阿洛糖基础增菌培养基的od管，每隔3小时，取出100μl培养液，用pbs稀释、涂板、计数，最后计算24小时内三种菌在阿洛糖基础增菌培养基中的生长速率并比较(图2)。如图所示，相同条件下，阿洛糖基础增菌培养基中单增李斯特菌的生长速率最快，伊氏李斯特菌的生长速率次之，无害李斯特菌的生长速率最慢。

实施例4.基础增菌培养基中细菌24小时生长浓度对比

1.菌株

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680)，伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)。

2.试剂

同实施例2。

3.培养基配制

按照实施例2配制。

4.细菌培养

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)、无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)、伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679,pam)分别在脑心培养基上培养24小时，然后挑取菌落在pbs中稀释到特定浓度。

5.生长速率测定

分别接种等量的单增李斯特菌、伊氏李斯特菌、无害李斯特菌到三个含有等量阿洛糖基础增菌培养基的od管，相同条件下培养24小时，取出后测od值，并用肉眼观察三者浊度有明显差别(图3)。如图3所示，含有单增李斯特菌的od管浊度最高，含有伊氏李斯特菌的od管浊度次之，含有无害李斯特菌的od管浊度最低。

实施例5.含有添加剂的培养基配制

1.盐酸吖啶黄溶液

0.1g盐酸吖啶黄溶于10ml蒸馏水，震荡混匀，配制成10g/l盐酸吖啶黄溶液，4℃保存备用。

2.萘啶酮酸溶液

0.1g萘啶酮酸溶于8ml蒸馏水，然后滴加1mol/l的naoh溶液，直至萘啶酮酸完全溶解，然后定容到10ml，配制成10g/l的萘啶酮酸溶液，4℃保存备用。

3.氯化锂溶液

3g氯化锂溶于10ml蒸馏水，配制成300g/l氯化锂溶液，4℃保存备用。

4.在实施例2配制的基础增菌培养基中加入适量添加剂，最终增菌培养基中盐酸吖啶黄的浓度为9.375mg/l，萘啶酮酸的浓度为7.5mg/l，氯化锂的浓度为2.25g/l。

实施例6.含有添加剂的增菌培养基中伊氏李斯特菌(pam)与无害李斯特菌(lin)生长状况观测

1.菌株

伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680)。

2.试剂

同实施例2，实施例5。

3.培养基配制

基础培养基加入不同浓度添加剂。

4.细菌培养

伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)分别在脑心培养基上培养24小时，然后挑取菌落在pbs中稀释到特定浓度。

5.生长速率测定

将制备好的无害李斯特菌与伊氏李斯特菌的混合菌悬液(无害李斯特菌：伊氏李斯特菌＝10:1)，分别接种到含有不同添加剂浓度(0×，0.25×，0.5×，0.75×，1.0×，以传统的half-fraser培养基中的添加剂浓度作为标准)的新型李斯特菌增菌培养基中，培养24小时后，分别计算各个增菌培养基中无害李斯特菌与伊氏李斯特菌的比例，确定最优添加剂浓度(图4)。如图4所示，为保证混合培养后伊氏李斯特菌的菌含量高于无害李斯特菌，同时确保添加剂对杂菌的抑制效果不会明显减弱，最终确定添加剂的浓度为0.75×。新型李斯特菌增菌培养基中添加剂的浓度与传统的half-fraser增菌培养基中相比减少了25％。

实施例7.新型李斯特菌增菌培养基与传统增菌培养基(half-fraser增菌培养基)对混合菌液的增菌培养效果比较

1.菌株

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680)，伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)。

2.试剂

同实施例2，half-fraser李斯特菌增菌培养基(oxiod)。

3.培养基配制

按照实施例5配制含添加剂的李斯特菌增菌培养基；按照厂家(oxiod)要求配制half-fraser增菌培养基。

4.细菌培养

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)、无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680，lin)、伊氏李斯特菌参考株(atcc-baa-679，pam)分别在脑心培养基上培养24小时，然后挑取菌落在pbs中稀释到特定浓度。

5.两种增菌培养基分离效果比较

将致病性李斯特菌(单增李斯特菌，伊氏李斯特菌)与无害李斯特菌的混合菌悬液分别接种到新型增菌培养基与传统half-fraser增菌培养基中，按照各自要求的培养条件，培养相同时间后，比较两种增菌培养基中致病性李斯特菌与无害李斯特菌的菌含量差异(图5)。如图5所示，伊氏李斯特菌与无害李斯特菌混合培养后，新型增菌培养基(laeb)中伊氏李斯特菌的菌含量高于无害李斯特菌，而传统增菌培养基(half-fraser)中只有无害李斯特菌存在；单增李斯特菌与无害李斯特菌混合培养后，新型增菌培养基(laeb)中只有单增李斯特菌存在没有无害李斯特菌，而传统增菌培养基(half-fraser)中单增李斯特菌与无害李斯特菌的菌含量接近。

实施例8.含有添加剂的增菌培养基对模拟样本中致病性李斯特菌的分离培养

1.菌株

单增李斯特菌参考株(atcc-baa-678，egd-e)，无害李斯特菌参考株(atcc-baa-680)。

2.试剂

胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸粉购自sigma公司，β-d-阿洛糖购自adamas公司，氯化钠磷酸氢二钠为国产分析纯。fraser增菌培养基购自oxide公司；盐酸吖啶黄、萘啶酮酸、氯化锂购自美国amresco公司。

3.培养基配制

按照实施例5配制含添加剂的新型李斯特菌增菌培养基；按照厂家(oxiod)要求配制half-fraser与fraser增菌培养基。

4.细菌培养

将上述两种细菌(单增李斯特菌，无害李斯特菌)分别接种到5ml脑心培养液中培养至od600＝0.6，用pbs稀释为不同浓度的菌悬液。

5.样品制备

从市场采购的新鲜猪肉，经eniso方法(样品在half-fraser与fraser培养基中经过两次增菌培养后，接种一环菌液到李斯特菌显色培养基，观察显色培养基上有无典型的李斯特菌菌落)鉴定不含有李斯特菌，加入单增李斯特菌和无害李斯特菌的混合菌液(菌含量比为1：10)。混匀后将标本均分为两份，一份加入到新型李斯特菌增菌培养基中培养24h后经显色培养基分离鉴定，另一份用eniso推荐的方法分离培养鉴定。

6.细菌分离培养结果

经新型李斯特菌增菌培养基培养后，显色培养基上绝大部分为单增李斯特菌菌落(图6)；经过传统的增菌培养基(half-fraser和fraser培养基)培养后，显色培养基上单增李斯特菌菌落只占细菌总量的少数(图7)，并且新型李斯特菌增菌培养基只需要一步增菌(24小时)，比传统的增菌分离方法减少了48小时。

实施例9.新型增菌培养基与传统增菌培养基(half-fraser)对模拟样本中致病性李斯特菌的分离效果比较

1.菌株

单增李斯特菌分离株(lm-082，lm-630，lm-716)，无害李斯特菌分离株(lin-010，lin-039)，伊氏李斯特菌分离株(liv-012，liv-020)。

2.试剂

胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸粉购自sigma公司，β-d-阿洛糖购自adamas公司，氯化钠磷酸氢二钠为国产分析纯。fraser增菌培养基购自oxide公司；盐酸吖啶黄、萘啶酮酸、氯化锂购自美国amresco公司。

3.培养基配制

按照实施例5配制含添加剂的新型李斯特菌增菌培养基；按照厂家(oxiod)要求配制half-fraser与fraser增菌培养基。

4.细菌培养

将上述7株细菌(单增李斯特菌，无害李斯特菌，伊氏李斯特菌)分别接种到5ml脑心培养液中培养至od600＝0.6，用pbs稀释为不同浓度的菌悬液。

5.样品制备

从市场采购的新鲜猪肉和牛肉，经eniso方法(样品在half-fraser与fraser培养基中经过两次增菌培养后，接种一环菌液到李斯特菌显色培养基，观察显色培养基上有无典型的李斯特菌菌落)鉴定不含有李斯特菌，将肉切碎，随机分为50份，分别加入致病性李斯特菌和无害李斯特菌的混合菌液(菌含量比为1：10)。混匀后将每份模拟标本均分为两份，一份加入到新型李斯特菌增菌培养基中培养24h后经显色培养基分离鉴定，另一份用eniso推荐的方法分离培养鉴定。

6.两种培养基分离效果比较

利用新型增菌培养基，50份模拟标本中有43份分离到致病性李斯特菌，分离率为86％；利用传统增菌培养基，50份模拟标本中有35份分离到致病性李斯特菌，分离率为70％。新型李斯特菌增菌培养基对致病性李斯特菌分离培养的灵敏度比传统增菌培养基提高了16％。