一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心elisa法
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，属于免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]单增李斯特菌是一种兼性厌氧性革兰氏阳性细菌，属于李斯特菌属。它主要以食物为传染媒介，是全球范围内的最致命的食源性病原体之一。李斯特菌在环境中分布广泛，肉类、蛋类、禽类、乳制品、蔬菜等均已被证实是李斯特菌的感染源。感染李斯特菌后会引起肌肉疼痛、恶心、腹泻等症状，严重的可引起血液和脑组织感染，而且由于该菌在4°C冷藏温度下仍可生长繁殖，被污染的冷藏食品对人类健康具有很大威胁。因此很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
[0003]李斯特菌属共分为10个种，包括单增李斯特菌(L.monocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.1uanuii)、英诺克李斯特菌(L.1nnocua)、威尔李斯特菌(L.welshimeri)等。其中单增李斯特菌是引起人类致病的主要原因。然而，作为食品卫生学的指标，李斯特菌常常被要求专门进行检测。检测李斯特菌属的方法目前主要有平板培养法、聚合酶链式反应法(PCR)、酶联免疫方法(ELISA)。
[0004]Elisa作为检测微生物的常用方法具有快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器，易于推广的特点。直接检测微生物的Elisa试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原，检测抗体一般为多克隆抗体或单克隆抗体。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点，比多克隆抗体具有更高的应用价值。本发明制备了李斯特菌属特异性单克隆抗体并建立起李斯特菌属特异性的双抗体夹心ELISA方法，为食品中李斯特菌属的监测与控制提供了分析手段。
【发明内容】
[0005](一)要解决的技术问题
李斯特菌属包括10个种，其中的单增李斯特种又分为13种亚型，种类较为繁多。如何实现对李斯特菌属的均一性、特异性检测是目前ELISA方法仍需要解决的问题。本发明的目的在于建立一种具有较高灵敏度、均一、特异性好、操作简单的ELISA方法用于检测食品中的李斯特菌属的。
[0006](二)技术方案
为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELI SA法，酶标板上包被了包被抗体2G7，可特异性捕获李斯特菌属内的李斯特菌，2H8-HRP为酶标抗体，包被抗体2G7与李斯特菌结合后催化底物在450nm产生吸收值，P/N 2 2.1时被判定为阳性，反之，P/N<2.1则判定为阴性； 抗体2G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCCN0.10875；
酶标抗体2H8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC N0.10876；
步骤为:
(I)李斯特菌属单克隆抗体的制备
以原核表达的单增李斯特菌P60蛋白(Listeria monocytogenes J0161, GenBank:AEO 02672.1)为免疫原，免疫8周龄BALB/c小鼠并通过杂交瘤技术融合小鼠脾脏。免疫程序如下:第一周进行首免，SOyg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射;第四周进行二免，80μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射;第六周进行三免，40yg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射;第七周尾部采血测效价，检测小鼠血清对李斯特菌属及其它杂菌的交叉反应;第九周进行四免，40yg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射;第十周检测小鼠血清对李斯特菌属及其它杂菌的交叉反应，筛选对李斯特菌属效价高，交叉均一并且对其它杂菌没有交叉的小鼠；第十二周进行冲刺免疫，20yg /只，生理盐水溶解，腹腔注射;冲刺免疫3天后眼眶采血后进行用常规杂交瘤技术融合小鼠脾脏。
[0007](2)采用多重筛选得到具有李斯特菌属特异性的细胞株。经常规免疫融合后用单增李斯特菌CMCC 54003菌体包被检测阳性，得到的阳性孔用ATCC 19111 (l/2a)、ATCC19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002( l/2c)、CMCC 54004^CMCC 54007、冻牛肉分离株(北京良润生物技术有限公司提供)以及李斯特菌属的ATCC 19119(Listeria ivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri, 6b)、ATCC25400(Listeria grayi)包被的板检测细胞株的交叉反应，(以上ATCC菌体见AmericanType Culture Collect1n，美国模式培养物保藏中心简称ATCC;以上CMCC菌株见国家微生物资源平台中国医学细菌保藏管理中心简称CMCC)挑选对李斯特菌属均有交叉反应的强阳性孔进行亚克隆；随后3次亚克隆后第7天均采用同样的方案检测阳性孔的交叉反应并选孔进行亚克隆；多重筛选得到15株李斯特菌属特异性单克隆抗体，分别标记辣根过氧化物酶HRP，并以单增李斯特菌CMCC54003为目标物进行两两配对；
(3)单克隆抗体的配对筛选
15株李斯特菌属特异性单克隆抗体纯化后分别标记HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下:包被抗体2G7 4yg/mL;包被液为pH 9.6、0.0lM的碳酸盐缓冲液;标品CMCC 54003浓度5X10~7CFU/mL;标品稀释液含0.1% Tween 20 的pH7.2、0.0lM的PBS;酶标抗体2H8-HRP稀释1000倍使用，实验成功得到了 18对P/N值>5的配对；
(4)李斯特菌属特异性ELISA方法的建立
配对后，比较不同配对的检测限和交叉反应，在此基础上，用包被抗体2G7和酶标抗体2H8-HRP建立了李斯特菌属特异性的夹心ELISA分析方法;具体参数如下:
包被抗体2G7包被浓度:4yg/mL，
包被液:pH9.6、0.0IM碳酸盐缓冲液，
样品稀释液:含0.1% Tween 20的pH 7.2、0.0IM的PBS溶液，
酶标抗体2H8-HRP浓度:2yg/mL，
反应时间:包被、封闭:37°C，2h ；标准品:37°C，Ih ；酶标抗体37°C，Ih ；显色1min ； 本方法对包括单增李斯特菌在内的李斯特菌属的快速，高灵敏检测;对单增李斯特菌ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b) 、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003、CMCC 54004、CMCC 54007、冻牛肉分离株以及李斯特菌属的ATCC 19119(Listeriaivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897 (Listeria welshimeri,6b)、ATCC 25400(Listeria grayi)的实际检测限(P/N 2 2.I)分别为I.36 X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.22X 106CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36X 105CFU/mL、1.36X15CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、4.53 X 104CFU/mL、l.36Χ 105CFU/mL、l.36Χ105CFU/mL、1.36 X 105CFU/mL;同时对P60蛋白的实际检测限达到了0.137 ng/mL，线性范围为0.13-11.1ng/mL;对测试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌没有交叉反应。
[0008]本发明方法的检测分析原理是:
酶标板上包被了捕获抗体2G7，合适的浓度下可以最大限度捕获李斯特菌属;洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220yL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37°C孵育Ih;洗板3次，加入酶标抗体2H8-HRP，37°C孵育Ih;洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品有足够的李斯特菌，被捕获抗体捕获后与酶标抗体2H8-HRP结合并催化底物在450nm产生吸收值(P/N > 2.1)，被判定为阳性;如果样品没有李斯特菌或浓度太低(P/N<2.1)那么样品不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。
[0009](三)有益效果
本发明制备了李斯特菌属特异性单克隆抗体并建立了李斯特菌属双抗体夹心ELISA法，该方法对包括单增李斯特菌在内的李斯特菌属均有交叉反应。该方法对单增李斯特菌及李斯特菌属的实际检测限(P/N 2 2.1)在4.53 X 14 CFU/mL到1.22 X 106CFU/mL之间。同时对P60蛋白的实际检测限为0.137 ng/mL，线性范围为0.13-11.1ng/mL。对测试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌没有交叉反应。
[0010]生物材料样品保藏:
单克隆细胞株2G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月 19日，保藏编号:CGMCC N0.10875。
[0011]单克隆细胞株2H8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏编号:CGMCC N0.10876。
【附图说明】
[0012]图1单克隆抗体2H8与李斯特菌属的交叉反应。
[0013]图2单克隆抗体2G7与李斯特菌属的交叉反应。
[0014]图3李斯特菌双抗体夹心ELISA法检测P60蛋白标准曲线。
[0015]图4李斯特菌双抗体夹心ELISA法检测李斯特菌属标准曲线。
具体实施方案
[0016]以下通过实施例进一步说明本发明。
[0017]—、仪器:
TGL—40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂
KFLOW纯水机，凯佛隆公司
ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂
96孔8 X 12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司
MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司
可调试移液器，Thermo Labsystems公司