专利名称：一种卵白蛋白双抗夹心elisa检测方法
一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法技术领域
本发明属于生物检验检疫领域，通过将卵清白蛋白免疫实验动物获得多克隆抗体，建立卵清白蛋白双抗夹心ELISA检测方法。
背景技术：
食物过敏是对食物中蛋白质分子产生的一种不良免疫反应。流行病学调查显示， 25%以上的人群受到过敏疾病的困扰。世界卫生组织(WHO )将牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、 蟹、龙虾)、花生、大豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦这8类食物定为常见的过敏食物。
鸡蛋中的蛋白质属于优质蛋白质，除了含有成年人所需要的八种必需氨基酸外， 还含有婴幼儿必须通过膳食补充的组氨酸，更是唯一一个蛋白质生物价达100的天然食物。然而正是这些对人体相当有益的蛋白质却可能成为儿童患过敏性疾病的祸首。不仅是儿童，某些先天性遗传缺陷的成年人同样有着对鸡蛋过敏的烦扰。据报道，鸡蛋过敏的高危人群为婴幼儿和儿童，是儿童继发性营养不良的原因之一。
迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用带鸡蛋的食物是鸡蛋过敏患者的最佳选择。然而鸡蛋营养丰富，若从鸡蛋过敏患者的膳食中除去鸡蛋，势必造成其营养不均衡。而且，由于现在食物配料的多样化，使食物的组成变得十分复杂，鸡蛋过敏患者很难避免遭受危害，因此，鸡蛋过敏已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危急生命，值得我们去关注和研究。
鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认蛋清中有4种蛋白成分能与人类血清结合而引起过敏反应，为鸡蛋的主要过敏原，它们分别是卵类黏蛋白、卵白蛋白OVA、卵转铁蛋白和溶菌酶。
目前国内检测卵白蛋白主要利用进口的酶联免疫检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，但是价格昂贵，而国内尚没有市售的OVA ELISA检测试剂盒。一般企业为节约检测成本，只使用其检测疫苗原液及成品，无法广泛用于工艺评价。发明内容
本发明提供一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，目的是建立快速、有效、低成本的卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法。
本发明采取的技术方案是 (一)抗卵白蛋白的单克隆抗体制备(a)采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方案用lmg/mL的卵白蛋白100 μ L与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μ L ； 首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；(b)细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1 :5 10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37°C水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔lOOul，放入37°C、5%0)2培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆， 然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20. 3%和73. 1%，阳性率分别为0和1. 78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，2011年12月7日在地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5557，分类命名产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4. SXlO8M-1 ；(二)制备抗卵白蛋白的多克隆抗体(a)用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西兰大白兔，免疫剂量为lmg/lmL/只，第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的卵白蛋白OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫，第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价，当血清效价达到24及以上时，心脏采血并在37°C放置ai，4°C静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体；(b)多克隆抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清，具体操作如下(1)1份血清加入3份醋酸盐缓冲液 CpH 4. 5)，混合均勻后于30min内逐滴加入正辛酸，边加边搅拌，加入辛酸的量为75ul/mL 兔血清。4°C静置Ih ;(2)4°C以12000rpm离心30min，弃沉淀收集上清并准确记录体积，加 Λ 1/10倍体积的PBSC0. 01Μ，ρΗ7· 0)，调ρΗ至7. 2，然后逐滴加入饱和硫酸铵至50%饱和， 边加边搅拌，4°C静置2h ； (3) 40C，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用适当体积的PBS (0. 01M, pH7. 0)溶起，逐滴加入饱和硫酸铵至33%饱和，4°C静置2h ； (4)重复第3步；5) 40C，12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS (0. 01M，pH7. 0)溶起，并于4°C 条件下在PBS (0. 01M, pH7. 0)中透析直到没有硫酸根离子为止；紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度，并分装保存至_80°C备用；(c)辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体纯化后的多克隆抗体用一种活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记，标记方法按照试剂盒说明书进行，具体操作方法如下(1) Img HRP用50μ 去离子水完全溶解后，加入50μ 纯化后的多克隆抗体溶液，含有多克隆抗体lOOPg，混合均勻后加入IOPL左右的启动剂，调ρΗ 至9. 5；(2) 4°C放置12h，加入少量的硼氢化钠，再加入终止剂，约3倍体积启动剂的量，调节ρΗ至7.0左右；(3)加甘油至50%，_20°C保存备用；(d)卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法(1)用纯化后的单克隆抗体4E9(5Pg/mL)包被ELISA板，100 PL/孔，4°C包被过夜；(2)0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；(3)加入新鲜配制的1%脱脂奶粉，100μ /孔，37°C包被Ih ；(4)0. 1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；(5)加入系列稀释的OVA标准品溶液或者待检样品及辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体(1:2000倍稀释)，各IOOPL/孔，37°C孵育Ih ；(6)0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；(7)加入OPD底物溶液，ΙΟΟμ ν孔，37°C避光反应15min；(8)加入2M硫酸终止反应，50μ /孔；(9)酶标仪492nm处读值，记录OD值；(10)绘制标准曲线，计算待检样品中OVA含量。
本发明卵白蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒的组装，试剂盒包括包被用的单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体、包被液、封闭剂、洗液、系列稀释的OVA标准品溶液、酶标多抗稀释液、底物溶液和终止液；包被抗体为单克隆抗体4E9，检测抗体为辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体，封闭剂为1%脱脂奶粉，酶标多抗稀释液稀释液为含有 1%BSA的PBST (0. OlM的PBS,含tween-20 0. 05%)，底物为OPD溶液，终止液为2M硫酸。
本发明包被抗体用特异性高的单克隆抗体，检测抗体用HRP标记的多克隆抗体， 检测程序简单方便，检测时间短，且灵敏度高，最低检测限可达到0. 31ng/mL，用于制备快速、有效、低成本的过敏原检测试剂盒，操作简单方便，一次操作时间不超过池，且可同时检测多个样品，节省时间，检测灵敏度高。
具体实施方式
实施例1用高纯度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠具体的免疫方法如下采用两种免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠，一种是足垫快速免疫方案用lmg/mL的 0VA100 μ L与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min。使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30 μ L。首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻后注射方法同上， 首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价。另一种是常规免疫方案首次免疫乳化方法同足垫快速免疫法，腹腔及背部皮下多点注射100yg/100yL的卵白蛋白，两周后进行加强免疫，100 μ g/100 μ L抗原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫每次间隔两周，四免后三天断尾检测小鼠血清效价。
实施例2细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆具体操作步骤如下强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏(足垫免疫小鼠无菌取出胭淋巴结)，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液(或者用注射器研磨胭淋巴结制备细胞悬液)，按1 :(5 10)的比例与SP2/0细胞充分混合， 在37°C水浴下与50%PEG1000进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的 HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔lOOul，放入37°C、 5%C02培养箱中培养，并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基，待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高，细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止，先后两次细胞融合的融合率分别为20. 3% 和73. 1%，阳性率分别为0和1. 78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5557，分类命名产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株。
实施例3单抗亚类鉴定及腹水大量制备具体方法如下(1)用检测原卵白蛋白OVA包被酶标板，4°C过夜；(2)PBST洗涤3次，甩干；(3 )加入适当稀释的腹水或细胞培养上清，37°C，Ih ；(4)PBST洗涤3次，加入单抗亚类鉴定试剂，37°C，Ih ；(5)PBST洗涤3次，甩干；(6)每孔加入IOOul底物溶液，37°C显色15min，酶标仪读值判断阳性结果。
单克隆抗体亚类鉴定
权利要求
1. 一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，其特征在于包括下列步骤(一)抗卵白蛋白的单克隆抗体制备(a)采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方案用lmg/mL的卵白蛋白100 μ L与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μ L ； 首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；(b)细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1 :5 10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37°C水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔lOOul，放入 37°C,5%C02培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换 HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价， 筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20. 3%和73. 1%，阳性率分别为0和1. 78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5557，分类命名产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为 4. 8 X IO8M"1 ；(二)制备抗卵白蛋白的多克隆抗体(a)用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西兰大白兔，免疫剂量为lmg/lmL/只，第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的卵白蛋白OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫，第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价，当血清效价达到24及以上时，心脏采血并在37°C放置ai，4°C静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体；(b)多克隆抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清，具体操作如下(1)1份血清加入3份醋酸盐缓冲液 CpH 4. 5)，混合均勻后于30min内逐滴加入正辛酸，边加边搅拌，加入辛酸的量为75ul/mL 兔血清，4°C静置Ih ;(2)4°C以12000rpm离心30min，弃沉淀收集上清并准确记录体积，加 Λ 1/10倍体积的PBSC0. 01Μ，ρΗ7· 0)，调ρΗ至7. 2，然后逐滴加入饱和硫酸铵至50%饱和， 边加边搅拌，4°C静置2h ； (3) 40C，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用适当体积的PBS (0. 01M, pH7. 0)溶起，逐滴加入饱和硫酸铵至33%饱和，4°C静置2h ； (4)重复第3步；5) 40C，12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS (0. 01M，pH7. 0)溶起，并于4°C 条件下在PBS (0. 01M, pH7. 0)中透析直到没有硫酸根离子为止；紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度，并分装保存至-80°C备用；(c)辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体纯化后的多克隆抗体用一种活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记，标记方法按照试剂盒说明书进行，具体操作方法如下(1) Img HRP用50μ 去离子水完全溶解后，加入50μ 纯化后的多克隆抗体溶液，含有多克隆抗体lOOPg，混合均勻后加入IOPL左右的启动剂，调ρΗ 至9.5 ;(2)4°C放置12h，加入少量的硼氢化钠，再加入终止剂，约3倍体积启动剂的量，调节pH至7.0左右；(3)加甘油至50%，_20°C保存备用； (d)卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法(1)用纯化后的单克隆抗体4E9(5Pg/mL)包被ELISA板，100 PL/孔，4°C包被过夜；(2)0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；(3)加入新鲜配制的1%脱脂奶粉，100μ 7孔，37°C包被Ih ；(4)0. 1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；(5)加入系列稀释的OVA标准品溶液或者待检样品及辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体(1:2000倍稀释)，各 οομ ν孔，37°C孵育Ih;(6)0. 1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；(7)加入OPD底物溶液，ΙΟΟμ ν孔，37°C避光反应15min；(8)加入2M硫酸终止反应，50μ /孔；(9)酶标仪492nm处读值，记录OD值；(10)绘制标准曲线，计算待检样品中OVA含量。
全文摘要
本发明涉及一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，属于生物检验检疫领域。抗卵白蛋白的单克隆抗体的制备，抗卵白蛋白的多克隆抗体的制备，包被抗体用特异性高的单克隆抗体，检测抗体用HRP标记的多克隆抗体，检测程序简单方便，检测时间短，且灵敏度高，最低检测限可达到0.31ng/mL，用于制备快速、有效、低成本的过敏原检测试剂盒，操作简单方便，一次操作时间不超过2h，且可同时检测多个样品，节省时间，检测灵敏度高。
文档编号G01N33/68GK102539788SQ20121001049
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者任洪林, 冯小丽, 卢士英, 周玉, 宋杰, 张茂林, 李兆辉, 李岩松, 柳增善 申请人:吉林大学