一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素i的双抗夹心法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素 I (SEI)的方法，具体涉及的是 一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素 I的双抗夹心法。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌肠毒素 （staphylococcal enterotoxins，简称SEs)，是一种由金 黄色葡萄球菌分泌的细胞外毒素，其会导致中毒休克、食物中毒及一系列过敏性、免疫学疾 病。目前已发现的肠毒素有23种血清型，其中SEA-SEE称为传统肠毒素，SEG-SEX为新型 肠毒素。其中SEI也属于新型肠毒素，它是由729个核苷酸构成，表达一个具有242个氨基 酸残基的成熟蛋白质，理论分子量为24. 928 KD。
[0003] 人类对于各型SEs最低耐受剂量不一，目前能引起中毒的肠毒素基因主要包括 SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SH^、SEG和SEI，其中A型肠毒素毒力最强，摄入lμg即能引起 食物中毒。但研宄表明，金黄色葡萄球菌肠毒素基因的各分型分布中，基因分布较广。 在临床研宄中发现，携带基因的金黄色葡萄球菌致病菌株的检出率高达89. 5%。基于 基因流行的广泛性，新型肠毒素 SEI潜在威胁人类健康。因此，食品及其原料中SEI的 检出，对控制SEI引起的食源性疾病具有重大意义。
[0004] 目前检测肠毒素的方法主要有免疫学法、分子生物学法和生物传感器法。
[0005] 基因往往以基因簇（e#)的形式存在，且肠毒素基因簇往往受同一操纵子调 控，从而导致一株葡萄球菌能同时表达两种以上的肠毒素。因此，国内外研宄重点是利用多 重PCR法对葡萄球菌肠毒素进行快速分型。PCR技术可从基因水平进行诊断，并能同时检 测大量样品，其高灵敏度和特异性可以直接应用于检测各类金黄色葡萄球菌产肠毒素的基 因。但PCR法只能判断葡萄球菌携带肠毒素的基因型，天然葡萄球菌肠毒素的表达往往受 到时间、水分活度（AW 0. 85~0. 99)、酸碱度（pH 4. 0~7. 0)和温度（8°C ~30°C)等因素的影 响，用PCR法很难对准确测定食品或临床样本中肠毒素蛋白的含量。
[0006] 免疫学检测法依靠抗原抗体的结合，其只发生在抗原决定簇与抗体结合位点之 间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，因此，免疫学检测法具有高度的特异 性。生物传感器技术因其具有自动化、检样量少、分析速度快、生物功能膜可多次使用等优 点受到国内学者的亲睐。最新研发的电化学免疫传感器对肠毒素最低检出限可达〇.〇17ng/ mL。但由于该方法检测成本高，检测稳定性较差，理论不成熟，使该方法的发展受到限制。另 一种酶联免疫吸附（ELISA)法因其具有操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、 稳定性高等优点，成为国内外研宄热点。
[0007] 目前，利用双抗体夹心法检测传统肠毒素的技术较为成熟，其灵敏度高达 0.0282ng/mL。但目前利用双抗体夹心法检测新型肠毒素的报道较少，特别是关于SEI的检 测采用该方法还未见报道，因此，双抗体夹心法在金黄色葡萄球菌新型肠毒素检测上将具 有相当广泛的应用价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于提供一种即可定性分析、也可定量检测，且灵敏度高、准确 度高的检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素 I的双抗夹心法。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素 I的双抗夹心法，包括以下步骤： (1) 用包被抗体包被酶标板，洗板，用于洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体 为SEI单克隆抗体； (2) 加入封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，洗板，用于洗去酶标板上多余封闭 液； (3) 在酶标板上加入样品，孵育后洗板； (4) 以SEI兔抗血清为一抗加入酶标板，反应后洗板，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔IgG为酶标二抗，反应后洗板； (5) 加入显色液使酶标板显色，然后加入硫酸终止反应，用酶标仪检测OD45tl, (6) 将检测得到的OD45tl值带入标准曲线即可求得样品中SEI的含量； 当样品中SEI浓度多0. 5 ng/mL，样品中SEI被配对抗体捕获与酶标二抗结合，并催 化底物在450 nm产生吸收值时，被判定为阳性； 当样品中SEI浓度< 0. 5 ng/mL，样品中SEI不被配对抗体捕获或者捕获数量太小不足 以引起足够的信号时，被判定为阴性。
[0010] 本发明记载的方法对不同浓度的标准SEI进行0045(|值检测后，得到的线性范围良 好，可以直接做成标准曲线，通过对样品的(》45(|值检测后，用该值在标准曲线上找出对应的 浓度，即可实现样品的定量检测。
[0011] 兔抗血清中存在非特异性蛋白，因而其很难达到较高的特异性，若选作包被抗体， 易造成假阳性，不利于抗原蛋白检测，导致检测的准确率较低。本发明将仅针对一种抗原决 定簇的SEI单克隆抗体作为包被抗体，将SEI兔抗血清作为一抗加入反应体系中，不仅克服 了直接使用兔抗血清所带来特异性问题，还提高了方法的灵敏度和准确性。
[0012] 目前常采用的Dot-ELISA检测法以硝酸纤维（NC)膜为固相载体，据文献报道，硝 酸纤维膜对蛋白的固定易受到非特异性蛋白、氢键作用干扰物、疏水作用干扰物的影响，从 而使膜上蛋白物理吸附能力变弱，易造成假阴性。而本发明采用聚苯乙烯酶标板作为固相 载体，其物理吸附能力较强，性质稳定，因而能克服因蛋白吸附问题而造成的假阴性。
[0013] 进一步，本发明优化了抗体包被浓度、一抗稀释度、酶标二抗稀释度、包被液、封闭 时间、标准品孵育时间、酶标抗体孵育时间、TMB显色时间等。通过该条件的设置可使检测 灵敏度达到0. 133 ng/mL，最低检测限0. 5 ng/mL，R2达到0. 9933。
[0014] 本发明中各步骤的具体工作条件和过程如下： 所述步骤（1)的具体过程如下：用2. 2~3. 5 μ g/mL的SEI单克隆抗体包被酶标板并在 4°C过夜，该SEI单克隆抗体的加入量优选为100 μ L/孔。
[0015] 所述步骤（2)的具体过程如下：以5120%脱脂奶粉为封闭液，在37°C下封闭I h~2 h，该封闭液的加入量优选为200 μ L/孔。
[0016] 所述步骤（3)中孵育的温度为37°C，孵育的时间为60~90 min。
[0017] 所述步骤（4)中一抗加入后在37°C下反应I h ;所述酶标二抗加入后在37°C下反 应30~45 min。该一抗和酶标二抗的加入量均优选为100 μ L/孔。
[0018] 所述步骤（5)中显色液加入后在37°C避光显色10~15 min ;所述硫酸浓度为2 mol/L。该显色液和硫酸的加入量均优选为100 μ L/孔。
[0019] 其中，所述步骤（1)中的包被抗体、步骤（2 )中的封闭液、以及步骤（4 )中的一抗和 酶标二抗均采用ρΗ=7. 4的I X PBS进行稀释，一抗的稀释比例为1:2000 ~ 1:4000,酶标 二抗的稀释比例为1:6000 ~ 1:8000。
[0020] 所述步骤（1)~步骤（4)中洗板的操作过程如下：倒去酶标板孔内液体，在吸水纸 上拍干，用含〇. 05% Tween-20的PBST加满孔，静置3 min，反复洗涤3~5次。
[0021] 所述显色液由10 mL显色液A、125 μ L显色液B、15 μ L 3% H2O2配置而成；其中 显色液A由3. 5 g的Na2HPO4.12H20、1. I g的柠檬酸混合后加水至200 ml，并调节pH值至 5.0后制得；显色液B由6 mg的3. 3'，5, 5'-四甲基联苯胺（TMB)加入I mL二甲基亚砜 (DMSO)混合制得。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： 1、 本发明不仅能有效对新型肠毒素 I进行定性分析，还能有效对新型肠毒素 I进行定 量检测，且检测准确度高； 2、 本发明中的试剂稳定、易保存，且操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、 稳定性高；且本发明能同时检测大量样品，适用于SEI检测和流行病学调查，具有良好的应 用前景。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明方法检测得到的标准曲线。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及其附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式 不局限于此。 实施例
[0025] 一、准备阶段 本阶段用于配置好相应浓度的各试剂物品等，本发明中所用试剂物品包括：包被抗体、 封闭液、样品、一抗、酶标二抗、显色液、硫酸。
[0026] 其中，酶标板为96孔聚苯乙烯可拆酶标板；该包被抗体为SEI单克隆抗体，SEI单 克隆抗体浓度为2. 2 ~ 3. 5 μ g/mL，封闭液浓度为5% ~ 20%的脱脂奶粉溶液，该SEI单克 隆抗体和封闭液均采用pH=7.4的I X PBS配置而成。样品包括检测样品和浓度分别为 0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL的 SEI 标准品稀释液。一抗为SEI兔抗血清，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，辣根 过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为市售产品，购自武汉三鹰生物技术有限公司。硫酸浓度为 2 mol/L〇
[0027] 所述SEI单克隆抗体的制备方法如下：以重组表达的SEI为免疫原，免疫6~8周龄 的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周进行初免，皮下多点注射；此后，每隔两周免疫一次， 共免疫三次，尾部采血测效价，选择效价最高的老鼠。再细胞融合前3天冲击免疫一次。眼 眶采血后进行融合，筛选采用间接ELISA进行，共筛选到2个细胞株；其中1株性质稳定， SEI单克隆抗体产量高。
[0028] 所述SEI兔抗血清的制备方法如下：将0. 3 mg SEI与等量弗氏完全佐剂混合，皮 下多点注射雌性新西兰大白兔1.0 mL ;3周后，以0.15 mg SEI与等量弗式不完全佐剂混 合，皮下多点注射新西兰兔I. 〇 mL ;3周以后每隔2周分别以0. 15 mg/只耳静脉注射新西 兰兔，最后1次免疫后7~10天内，颈动脉采全血，37°