专利名称：转基因植物BtCry1Ac蛋白双抗夹心ELISA检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体地涉及检测BtCrylAc蛋白的ELISA检测方法。
背景技术：
自1983年首次报道植物的遗传转化以来，人们利用转基因技术已成功培育出了许多转基因植物新品种，并在农业生产中推广应用，获得了显著的经济效益。转基因植物在提高作物产量、改善作物品质、减少农药使用量等方面发挥着重要的作用。同时，随着转基因植物的大面积种植，转基因植物本身的安全性及其对人类健康的潜在风险和对生态环境的长期影响已成为国际社会和广大民众普遍关注的热点。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi,简称Bt)是一种能产生杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystal protein)的革兰氏阳性菌,其孢子及伴孢晶体对鳞翅目和鞘翅目的一些害虫具有一定的毒杀作用。自1938年第一个Bt商品制剂问世以来，因其毒力高，致病快，且对非靶标生物及人类无毒，对环境安全，已作为微生物杀虫剂广泛应用于害虫的防治。Bt毒蛋白基因是目前应用最为广泛和最有潜力的一个抗虫基因，已有近70种植物被转入了 Bt毒蛋白基因而获得了抗虫性。目前国内外已经获得转Bt基因作物有棉花、水稻、玉米、小麦和油菜等。转基因植物蛋白在调节植物抗病虫和抗莠等方面意义重大，是转基因植物安全性评价的主要指标之一。目前转基因产品的检测主要是从两个方面入手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测。对于转Bt基因植物中毒蛋白含量的检测，国内外目前主要有生物测定法和免疫检测法。生物测定法是根据不同昆虫对毒蛋白不同敏感性或者同一昆虫的不同死亡率来进行的。主要以棉铃虫取食Bt棉器官后的死亡率、化蛹率、羽化率、体重变化等作为指标。但需统一虫源、虫龄，统一取样部位，统一饲养条件，测定所需时间长，并且定量的准确性也不高，结果变异系数大；另外，虫测所需样品量大，对苗期植株会造成伤害，影响后期生长。免疫检测法中的Western blot是将蛋白质从SDS-PAGE胶中电转移到固相载体上，然后对固定化蛋白质进行免疫学检测，可以测试粗蛋白提取物中小于50ng抗原，但该方操作繁琐且费用较高，不适合高通量检测，其检测极限有限，因此不能广泛应用。试纸条法快速、简便，便于推广，但易出现假阳性，不能区分具体的转基因品系，且检测灵敏度低。酶联免疫吸附实验(ELISA)是一种快速、准确、灵敏、操作简便的免疫酶检测技术，已应用于转基因植物表达的定量检测。目前国内检测Bt蛋白主要采用间接ELISA法，但该方法检测的结果不准确、重复性差。针对目前转基因植物蛋白准确定量方法缺乏，以及由此产生的检测结果不准确、重复性差等问题，急需一种选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确、实用性强的检测转基因植物蛋白的方法，用于现场检测。我国在转基因植物蛋白的检测方面缺乏权威定量方法，难以保证检测结果的准确性和可比性。为了适应转基因植物的发展和应用的要求，必须迅速发展转基因植物蛋白安全性评价技术，研究转基因植物蛋白的准确计量方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测转基因BtCrylAc蛋白的方法，以克服现有技术中的上述不足。本发明的另一个目的是提供一种检测转基因BtCrylAc蛋白的ELISA试剂盒。本发明的技术方案设计图见图1。本发明提供的一种定量检测转基因BtCrylAc蛋白的ELISA方法，是用BtCrylAc蛋白的单克隆抗体包被微孔板，分别加入标准BtCrylAc蛋白和待测样品，再与酶标BtCrylAb蛋白单克隆抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗涤后加底物显色，用酶标仪在450nm波长下测定OD值,制得标准BtCrylAc蛋白的标准曲线。通过标准曲线计算待测样品中BtCrylAc蛋白浓度。所述BtCrylAc蛋白单克隆抗体是鼠抗BtCrylAc蛋白。所述酶标抗体是BtCrylAb蛋白单克隆抗体-HRP。本发明还提供一种检测转基因BtCrylAc蛋白的ELISA试剂盒，含有酶标板和酶标抗体，酶标板包被BtCrylAc蛋白单克隆抗体,酶标抗体为酶标BtCrylAb蛋白单克隆抗体。所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。当标记酶为辣根过氧化物酶时,所述显色剂为TMB。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述终止液为2mol/L硫酸溶液。本发明提供了上述双抗夹心ELISA检测方法或其试剂盒在检测转基因植物中BtCrylAc蛋白的应用。所述的转基因植物为玉米和/或棉花。本发明建立了一种灵敏准确、稳定性好、实用性强的Bt杀虫蛋白CrylAc的ELISA检测方法，用于转基因玉米或棉花中Bt杀虫蛋白含量的检测。本发明的检测方法能够定量检测待测样品中BtCrylAc蛋白的含量，保证了检测结果的准确性和可比性，弥补了我国目前缺乏转基因植物蛋白权威定量方法的现状。本发明建立的方法对我国转基因植物的安全评价及相关法律法规的制定具有重要的科学价值和现实指导意义。
图1为本发明技术方案图；图2为硫酸铵沉淀、Protein G纯化、二步纯化的配对抗体测定CrylAc蛋白的柱形图； 图3为二步纯化的配对抗体测定标准CrylAc蛋白的标准曲线图；图4为实际检测样品的标准曲线图，以减去空白孔后的OD值作为纵坐标，标准BtCrylAc蛋白浓度作为横坐标。
具体实施例方式但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂、器材及其来源:BABL/c小鼠，来自扬州大学；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司)；96孔酶标板(CORNING公司)；酶标仪(ThermoScientific公司)；紫外可见光光谱仪(Perking Elmer公司)；胎牛血清(杭州四季青公司);RPM1-1640 培养基(Hyclone 公司)；PEG4000 (Merck) ；TMB (Sigma) ;96、24 孔细胞培养板、250112、750112细胞培养瓶、15，501111离心管均购自美国CORNING公司；HAT，HT(GIBC0公司)；Bt CrylAb蛋白、Bt CrylAc蛋白由美国Envirologix公司原装进口 ；辣根过氧化物酶(HRP)，上海国源生物技术有限公司；高碘酸钠、硼氢化钠、三水合乙酸钠、乙酸(冰醋酸)、硫酸铵等常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；酪蛋白C8200，Sigma公司生产，购自北京索莱宝公司；BSA Amresco生产,购自江阴泰诺公司；羊血清,购自郑州益康公司；TMB52-00-04购自北京西美杰。实施例1抗体的制备1.免疫BALB/c小鼠选用6周龄的雌性BALB/c小鼠(8只)作为免疫动物，转基因蛋白Bt CrylAc, Bt CrylAb分别与等量弗氏完全佐剂乳化后，分别对实验小鼠采用皮下多点注射(100 μ g/只)，每种蛋白分别注射4只小鼠。间隔4周加强免疫，转基因蛋白CrylAc、CrylAb分别与等量弗氏不完全佐剂乳化后多点皮下注射实验小鼠(100 μ g/只)，加强免疫2次，两次免疫间隔4周。最后一次加强免疫后一周断尾采血，分离血清，以转基因蛋白为检测抗原测定小鼠血清抗体效价，效价基本都在1: 10万以上。2.杂交瘤细胞的建立细胞融合时提前3天用30 μ g转基因蛋白BtCrylAc和BtCrylAb分别对融合小鼠进行加强免疫。选择状态良好的、对HAT敏感的SP2/0细胞株，免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按1:1混合，聚乙二醇-4000为融合剂，将融合好的细胞铺进96孔细胞培养板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液。用ELISA法(转基因蛋白Bt CrylAc和Bt CrylAb分别为检测抗原)筛选阳性克隆孔，有限稀释法克隆3次至阳性率达到100%，细胞建株，扩大培养，并液氮冻存杂交瘤细胞株。3.单克隆抗体的制备取7周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.2mL。10天后腹腔接种IO6左右的杂交瘤细胞。7-10天后小鼠腹部明显膨大，用弯头滴管采集腹水，间接ELISA测定腹水抗体效价。4.抗体的纯化采用硫酸铵沉淀法与Protein G沉淀法相结合的方法进行抗体的纯化，分别获得两种纯化抗体(即转基因Bt CrylAb蛋白的单克隆抗体和转基因Bt CrylAc蛋白的单克隆抗体)，测得蛋白质含量为3mg/ml，-20°C冻存备用。硫酸铵沉淀后用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5mL0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续IOmL0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5mL0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 7.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入IM Tris-HCKpH 2.7)中和甘氨酸，使PH保持为适合抗体保存的中性；IOmL0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5mL 20%乙醇溶液过柱，于4°C条件下保存纯化小柱。实施例2酶标抗体的制备(I)称取4mg HRP溶于ImL纯水中，加入200 μ L IOOmM高碘酸钠(现配现用)，4°C搅拌20min，至溶液呈墨绿色；(2)将上述溶液置于ImM pH4.4醋酸缓冲液中透析过夜；(3)用0.1M碳酸盐缓冲液调上述HRP溶液pH为9.0 ;(4)将6mg Bt CrylAc或Bt CrylAb的单克隆抗体各自加入HRP溶液中，4°C搅拌2h ；(5)继续加入100 μ L 4mg/ml硼氢化钠，4°C避光搅拌2h ；(6)使用pH 8.5硫酸铵饱和溶液对以上溶液进行硫酸铵沉淀，离心之后管底所得褐色沉淀物即为实验所得酶标抗体。Bt CrylAb的酶标抗体为Bt CrylAc蛋白单克隆抗体-HRP，Bt CrylAc的酶标抗体为BtCrylAb蛋白单克隆抗体-HRP。实施例3Bt CrylAc夹心ELISA检测方法的建立用ELISA的方法筛选出关于Bt CrylAb蛋白、Bt CrylAc蛋白的配对抗体。1、溶液的配置(I)配置包被液:将0.3g NaCO3和0.58g NaHCO3加双蒸水定容至100mL。(2)配置稀释液，配方如下:
Na2HPO4-UH2O3.35 g NaH2PO4^H2O0.2 g
NaCl8.0 g
KCl0.2 g
Casein1.0 g
ddH201000 mL(3)配置洗涤液，配方如下:
Na2HPO4-UH2O3.35 g
NaH2PO4JH2O0.2 g
NaCl8.0 g
KCl0.2 g
Tween-202.0 mL
ddH201000 mL2、包被(I)将Bt CrylAb单抗、Bt CrylAc单抗,其纯化方法分别是硫酸铵沉淀法、Protein G纯化法、硫酸铵沉淀+Protein G纯化法用pH9.6的包被液按照1: 100倍稀释，分别进行试验。于96孔包被板上，IOOyL/孔，4°C过夜；(2)洗涤液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin。3、封闭(I) 10%羊血清封闭(用包被液按照1: 9倍稀释)，每孔150yL，恒温37°C封闭3小时；(2)洗涤液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，时间为lmin。
4、加样(I)包被Bt CrylAc单抗的96孔板中依次加入浓度梯度为100、50、25、O μ g/L的CrylAc抗原标准品100 μ L/孔，各2孔；或包被Bt 07认13单抗的96孔板中依次加入浓度梯度为10(^8/1、5(^8/1、25 48/L、0 μ g/L的CrylAb抗原标准品100 μ L/孔,各2孔；(2) 37°C, thermo恒温箱温育60min ；
(3)洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 μ L，时间为lmin。5、加酶(I)用稀释液按I: 100比例稀释Bt CrylAb蛋白单克隆抗体-HRP，或BtCrylAc蛋白单克隆抗体-HRP，充分混匀；(2)包被Bt CrylAc单抗的96孔板，取2板，一个加稀释后的Bt CrylAb蛋白单克隆抗体-HRP，100 μ L/孔；另一个板加稀释后的Bt CrylAc蛋白单克隆抗体-HRP，100 μ L/孔，用以进行配对抗体的筛选；(3) 370C，thermo恒温箱温育60min ； (4)洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300 μ L，时间为lmin。6、显色反应加 TMB 100μ L，37°C反应 15min。7、检测结果加入2M H2SO4,100 μ L/孔。酶标仪测读数:450nm读取OD (吸光度)值。本实验通过大量实验进行配对反应，最终筛选结果发现，包被BtCrylAc单抗的酶标板中添加酶标抗体是Bt CrylAb蛋白单克隆抗体-HRP时，抗体与抗原结合的效果最好，包被Bt CrylAb单抗的酶标板中添加酶标抗体是Bt CrylAc蛋白单克隆抗体-HRP时,抗体与抗原的结合效果最好。见表1、表2。所以在测定BtCrylAc蛋白时Bt CrylAc单抗可以与Bt CrylAb蛋白单克隆抗体-HRP配对，且配对效果最好。同时在三种不同的纯化方案中，二步纯化可以使本底得到有效的降低，见图2，因此采用先硫酸铵沉淀后Protein G纯化的二步纯化方案。用二步纯化的配对抗体测定CrylAc蛋白的标准曲线见图3。表I硫酸铵沉淀、P rotein G纯化、二步纯化的配对抗体测定不同浓度CrylAc蛋白的OD值
权利要求
1.一种定量检测转基因植物BtCrylAc蛋白的ELISA方法，其特征在于，用BtCrylAc蛋白的单克隆抗体包被微孔板，分别加入标准BtCrylAc蛋白和待测样品的稀释液，再与酶标BtCrylAb蛋白抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗涤后加底物显色，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，制得标准BtCrylAc蛋白的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中BtCrylAc蛋白浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BtCrylAc蛋白单克隆抗体是鼠抗BtCrylAc 蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
4.一种检测转基因BtCrylAc蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，包括有酶标板和酶标抗体，所述的酶标板包被BtCrylAc蛋白单克隆抗体,所述的酶标抗体为酶标BtCrylAb蛋白单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
6.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色剂为TMB。
7.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述终止液为2mol/L硫酸溶液。
8.权利要求1 3任一所述的方法或权利要求4 7任一所述的试剂盒在检测转基因植物中BtCrylAc蛋白的应用。
9.如权利要求8所述的应用，所述的转基因植物为玉米和/或棉花。
全文摘要
本发明提供一种检测转基因植物中BtCry1Ac蛋白的双抗体夹心ELISA方法。该方法是用纯化的BtCry1Ac单克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，加入标准BtCry1Ac蛋白和待测样品，再与酶标BtCry1Ab蛋白单克隆抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗涤后加底物TMB显色，用酶标仪检测OD450nm值，根据标准BtCry1Ac蛋白的检测结果制得标准曲线。通过标准曲线计算待测样品中BtCry1Ac蛋白浓度。本发明还提供了检测转基因BtCry1Ac蛋白的ELISA试剂盒。本发明的方法及试剂盒检测结果准确、稳定、灵敏度高，可用于我国及进口的转基因植物中转基因植物蛋白的测定。
文档编号G01N33/68GK103116027SQ20111036328
公开日2013年5月22日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者周晓萍, 刘洋, 张经华, 王启辉, 勾新磊, 刘奕忍, 陈瞾 申请人:北京市理化分析测试中心