基于蛋白底物的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物化学领域的测定方法及其应用，特别是涉及一种基于蛋白底 物的检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 尽管在体内蛋白酶的底物是具有全长氨基酸序列的蛋白质，但是大部分用于生物 学研宄和药物开发的蛋白酶测定方法都采用多肽作为蛋白酶的底物。多肽是蛋白质的小片 段（其序列源于蛋白质）。尽管多肽与其源蛋白的相应片段有着相似甚至完全相同的氨基 酸序列，但是它仍然缺乏许多关键的结构和功能，这是因为它没有蛋白质的三级结构。因 此，在针对某一目标蛋白酶进行药物筛选、优化和构效关系分析时采用多肽作为底物就会 存在许多严重的缺陷。
[0003] 多肽底物是根据酶切位点附近的序列进行设计的，这保证了其具有一定的特异 性。在常规的方法中多肽的一端被标记上荧光，另一端被标记上该荧光的淬灭基团，当多肽 被蛋白酶水解成两段后，荧光基团和淬灭基团分离导致荧光强度的增加从而进行检测。这 类方法被广泛采用并作为标准方法用于蛋白酶药物筛选、构效关系分析以及酶动力学和相 关机制的研宄。但是这些多肽没有其源蛋白所具有的特定的构象从而导致一系列严重的缺 陷。
[0004] 使用多肽作为底物的其中一个缺陷就是蛋白酶和蛋白底物的相互作用不仅仅局 限于蛋白酶的活性位点和蛋白酶底物的酶切位点之间，蛋白的其它部分也参与这些相互作 用。底物蛋白的整体结构在反应专一性上可能起关键作用，这类的相互作用在多肽底物上 是完全不存在的。
[0005] 使用多肽作为底物的另一个缺陷就是底物蛋白表面的结合位点在多肽上完全缺 失。这将导致那些结合在底物蛋白上的化合物无法通过多肽底物筛选出来。另外多肽底物 在pH和其他反应条件上可能和天然蛋白底物相差很大。
[0006] 以上由于使用多肽底物产生的问题可以通过使用天然蛋白底物来解决。然而由于 天然蛋白底物在操作上存在一定难度从而导致天然蛋白底物很少被用于蛋白酶相关生物 学测定方法上。常规天然蛋白底物用于蛋白酶活性测定的其中一个缺点就是反应通常需要 终止，然后产物需要通过电泳或色谱进行分离。这些步骤费时费力，无法实现高通量并且定 量上缺乏准确性。
[0007] 由此可见，需要一种改进的方法体系以便采用全长蛋白底物进行蛋白酶相关生物 学实验。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于蛋白底物的检测方法及其应用。其中， 该方法是一种利用位点特异性标记的全长蛋白作为底物或位点特异性标记的具有独立折 叠结构域的蛋白作为底物的检测方法，且该方法可应用于药物筛选领域，以便实现高通量 筛选药物，加快药物的开发。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明的基于蛋白底物的检测方法，包括步骤：
[0010] 1)制备带有待测蛋白酶识别位点的蛋白底物；
[0011] 2)在蛋白底物的待测蛋白酶识别位点上连接检测组分，形成位点特异性标记的蛋 白底物；
[0012] 3)位点特异性标记的蛋白底物与待测蛋白酶进行相互作用；
[0013] 4)根据特异性标记的信号变化，检测蛋白底物与待测蛋白酶的相互作用。
[0014] 所述步骤1)中，蛋白底物包括：全长的蛋白底物、具有独立折叠结构域的蛋白底 物；其中，全长的蛋白底物包括：全长的蛋白酶底物；
[0015] 步骤1)中，待测蛋白酶识别位点（特异性位点）包括：酶切位点。
[0016] 步骤1)中，蛋白底物的制备方法，可包括以下步骤：
[0017] I、根据待测蛋白酶（即目的蛋白酶）的氨基酸序列，对其编码基因的序列进行优 化（如密码子偏好的优化），随后合成被优化的基因，得到蛋白底物的核苷酸序列；
[0018] II、将蛋白底物的核苷酸序列克隆到载体中，转化入原核表达系统或真核表达系 统中，并进行蛋白底物的表达；
[0019] III、纯化蛋白底物。
[0020] 其中，所述步骤II中，载体包括：质粒pE-SUMO或pTXBl ;原核表达系统包括：大肠 杆菌；真核表达系统包括：哺乳动物细胞。
[0021] 所述步骤III中，纯化的方法包括：亲和层析、离子层析或分子筛层析。
[0022] 所述步骤2)中，检测组分包括：荧光染料、荧光淬灭剂或者荧光染料及其淬灭剂 的组合；在蛋白底物的待测蛋白酶识别位点上连接检测组分的方法包括：在待测蛋白酶识 别位点的一端标记上荧光基团，另一端标记上该荧光基团的淬灭基团。
[0023] 所述步骤3)中，待测蛋白酶包括：Renin酶或BACE酶。
[0024] 所述步骤4)中，特异性标记的信号变化包括：荧光信号变化；其中，所述荧光信号 变化包括：荧光强度或荧光各向异性的变化。
[0025] 另外，本发明还提供一种上述方法的应用，即用于化合物的筛选，如本发明还提供 一种基于上述检测方法的化合物筛选方法，其包括步骤：
[0026] (1)制备带有待测蛋白酶识别位点的蛋白底物；
[0027](2)在蛋白底物的待测蛋白酶识别位点上连接检测组分，形成位点特异性标记的 蛋白底物；
[0028] (3)位点特异性标记的蛋白底物、待测蛋白酶与待筛选化合物进行相互作用；
[0029] (4)根据特异性标记的信号变化，检测位点特异性标记的蛋白底物、待测蛋白酶与 待筛选化合物进行相互作用，以筛选出作用于蛋白底物的化合物或筛选出作用于待测蛋白 酶的化合物。
[0030] 所述步骤⑷中，作用于待测蛋白酶的化合物包括：待测蛋白酶的抑制剂。
[0031] 此外，本发明还提供一种用于化合物筛选的试剂盒，其包括：上述带有待测蛋白酶 识别位点的蛋白底物；或者
[0032] 上述带有待测蛋白酶识别位点的蛋白底物与待测蛋白酶。
[0033] 此外，对于上述化合物的筛选，具体的操作可如下：
[0034] 1、如图5、7、9、12所示根据目的蛋白的氨基酸序列对其编码基因的序列优化，优 化的基因随后被合成出来，从而得到编码全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物的核 苷酸序列。
[0035] 2、将合成的目的基因通过分子生物学试验手段克隆到特定的表达载体中，其中会 融合特定的标签便于后续的纯化，随后含有目的基因的表达载体被转化入原核或真核表达 系统中，如大肠杆菌和哺乳动物细胞等。然后通过诱导表达等方式就可表达出全长蛋白底 物或具有独立结构域的蛋白底物，如图10A所示。
[0036] 3、表达出的全长蛋白底物或具有独立结构域的蛋白底物通过一系列的纯化而得 到具有较高纯度的目的蛋白。这些纯化方法包括亲和层析、离子层析、分子筛层析等蛋白纯 化方法。
[0037] 4、通过化学合成带有荧光标记或其他化学修饰标记的多肽。
[0038] 5.如图2、5、7、9、12所示利用内含肽介导的蛋白拼接方法将带有荧光标记或其他 化学修饰标记的多肽连接到目的蛋白的特定位点，由此得到位点特异性标记的全长蛋白底 物或具有独立结构域的蛋白底物。
[0039] 6.如图10B、C所示，通过亲和层析、离子层析、分子筛层析等纯化方法去除冗余的 多肽，得到纯化后的荧光标记或其他化学修饰标记的蛋白底物。
[0040] 7.如图3、4、6、8、11、13所示，用目的分析物和荧光标记或其他化学修饰标记的蛋 白底物相互作用以建立药物筛选方法，通过荧光可对酶切反应进行实时监测，从而在实现 尚通量筛选的如提下提尚药物筛选几率。
[0041] 考虑到旧工艺的问题和缺陷，在本发明的一个或多个方案中，其中一个目标就是 提供一种可以基于蛋白底物的蛋白酶测定方法，这包括提供全长蛋白底物以及将特定的检 测组分连接到全长蛋白底物的特定位点以形成位点特异性标记的全长蛋白底物。通过目的 分析物和位点特异性标记的全长蛋白底物之间的相互作用来进行药物研发。
[0042] 在本发明的各种方案中检测组分可以是荧光，由此可得到位点特异性荧光标记的 蛋白底物。在这一方案中通过测定反应过程中或反应完成后的荧光信号变化来建立检测方 法。这种即时实验用于药物开发就可能会发现与目的分析物相互作用的化合物或者与位点 特异性荧光标记的蛋白底物相互作用的化合物。检测组分可以是荧光染料、荧光淬灭剂或 者荧光染料及其淬灭剂的组合。
[0043] 根据本发明，全长蛋白底物可以是蛋白酶底物，由此可得到位点特异性标记的蛋 白酶底物。在药物开发中会发现一种与位点特异性标记的蛋白酶底物相互作用的化合物。 [0044] 在本发明的特定方案中，对于蛋白测定实验来说还包括酶切全长蛋白底物的各个 步骤，通过在酶切位点附近连接检测组分来实现。在这一方案中酶切位点的一端标记上荧 光基团，酶切位点的另一端标记上该荧光基团的淬灭基团。
[0045] 在各种其他方案中，与本发明相关的各种体系方法中还包括具有独立折叠结构域 的蛋白底物，在该独立折叠结构域的蛋白底物的特定位点上标记上检测组分即可得到位点 特异性标记的具有独立折叠结构域的蛋白底物。目的分析物可以与位点特异性标记的具有 独立折叠结构域的蛋白底物相互作用，通过该相互作用建立的检测方法可用于药物开发。
[0046] 在本发明的这些体系方法中，对于蛋白测定实验来说还包括酶切具有独立折叠结 构域的蛋白底物，通过在酶切位点附近连接检测组分来实现。在这一方案中酶切位点的一 端标记上荧光基团，酶切位点的另一端标记上该荧光基团的淬灭基团。
[0047] 在本发明的各种方案中检测组分可以是荧光，由此可得到位点特异性荧光标记的 具有独立折叠结构域的蛋白底物。具有独立折叠结构域的蛋白底物可以是蛋白酶，由此可 以在药物开发中得到与蛋白酶相互作用的化合物。
[0048] 在本发明的各种方案中检测组分可以是荧光染料和/或该荧光染料的淬灭基团。 在这一方案中通过测定反应过程中