一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体及其应用的制作方法

文档序号：11107309阅读：827来源：国知局

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种使用荧光偏振法对乳铁蛋白进行检测的适配体及其应用。

背景技术：

荧光偏振技术作为一种简单可靠的信号传导手段，可以基于荧光基团的分子质量的变化提供关于分子取向、迁移和作用过程的信息。荧光偏振分析法具有很多的优势：第一，它是一种均相分析方法且灵敏度高，无需分离等复杂操作，结果重现性好；第二，响应时间快，可以实时监测分子间相互作用；第三，可以与酶标仪等仪器联用，可以实现自动化高通量测定；第四，荧光偏振依赖于两个垂直方向上的荧光强度的比值，与荧光绝对强度无关，荧光偏振值对荧光的波动及光漂白不敏感，从而成为在复杂生物样品中均相测定目标分子的理想分析方法。因此，荧光偏振技术在荧光传感应用中受到广泛的研究关注。

乳铁蛋白是一种极具广阔市场前景的功能性蛋白，它主要存在于哺乳动物的乳汁中，其含量与动物的种属息息相关，以人乳、牛乳为典型代表。研究表明，乳铁蛋白具有多种生物学活性。它具有参与铁代谢、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、阻断氧自由基、免疫调节及抗炎症、促进细胞增长、减少内脏脂肪等多种功能。且由于乳铁蛋白是一种可被婴儿摄入的、安全极高的天然乳成分，其在日本被批准为食品添加剂，在美国被纳入一般认为安全物质之中。加之，乳铁蛋白广泛的生物学功能深受国内外食品相关企业的高度重视，在我国GB 14880—2012《食品营养强化剂使用标准》中，乳铁蛋白也被列为一种新型营养强化剂并规定了其在相关乳制品中的含量标准。因而，能否建立快速准确的乳铁蛋白检测技术对于食品安全来说至关重要。目前，适合不同类型生物样品中乳铁蛋白的检测技术主要有分光光度法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法、高效毛细血管电泳法以及表面等离子共振技术等检测技术，但这些方法依然存在前处理过程复杂、实际样品回收率低、稳定性差等特点，因此建立出一种能够全面实现准确、快速、无需对样品进行前处理的全自动乳铁蛋白检测方法十分重要且紧迫。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体。

本发明还要解决的技术问题是提供上述适配体在检测乳铁蛋白中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测乳铁蛋白含量的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～65所示，所述的适配体优选SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.35。

上述用于检测乳铁蛋白含量的适配体在检测乳铁蛋白中的应用。

一种荧光偏振法测量阴性蛋白含量的方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准曲线：向10μL、40nM～4000nM异硫氰酸荧光素标记的适配体溶液中加入100μL不同浓度的阴性蛋白标准样品，混匀，所述适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1～61中的任一种，25℃～40℃下反应5～120min，用酶标仪检测，激发波长为480nm，发射波长为528nm，绘制标准曲线；

(2)样品检测：将异硫氰酸荧光素标记的适配体与待测样品混合，按照步骤(1)的条件检测。

其中，所述异硫氰酸荧光素标记的适配体的浓度为40nM～4000nM；

其中，所述待测样品的浓度为0.78～50μg/mL。

其中，所述的阴性蛋白为乳铁蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、BSA，优选乳铁蛋白。

有益效果：

本发明以FITC标记的适配体为探针，通过乳铁蛋白与探针的特异性结合使荧光偏振信号发生改变，且乳铁蛋白浓度对数值与荧光偏振信号呈线性变化，从而实现对乳铁蛋白的定量检测。该种荧光偏振法灵敏度高，抗干扰性非常强，可以有效避免假阳性信号，实现对复杂样品中目标物的测量，如牛奶中乳铁蛋白的测量，该方法检测的线性范围为0.78～50μg/mL。

附图说明

图1荧光偏振法反应时间优化图。

图2不同浓度乳铁蛋白与荧光偏振信号关系图。

图3荧光偏振法对乳铁蛋白特异性检测图。

图4荧光偏振法对乳铁蛋白检测线性图。

图5其他适配体对乳铁蛋白荧光偏振检测线性图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：乳铁蛋白适配体筛选

乳铁蛋白适配体筛选的具体步骤，包括芯片制备、正负筛过程、PCR扩增等详细过程，具体如下所述，其中：

文库：5′-TAMRA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3′

TARMA修饰的前向引物：5′-TARMA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-3′

生物素化的后向引物：5′Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG-3′

(1)芯片制备：利首先利光刻掩模与化学腐蚀相结合的技术制作微流控通道模板作为PDMS通道制做磨具；后称取质量比为10：1的PDMS前聚体与固化剂充分混合，抽真空后浇到微流控通道模板上经固化后得到PDMS微流控通道；使用点样仪在玻璃基片点制浓度为5mg/mL的乳铁蛋白和阴性蛋白微阵列，并对PDMS和点样后的玻璃基片同时等离子处理，之后紧密贴合共同作为筛选芯片，用于接下来的每轮筛选；筛选准备：将步骤(1)得到的筛选芯片放入恒温水浴箱中37℃下孵育蛋白2h；再通入20mg/mlBSA和0.01mM随机序列短链ssDNA(20nt)在37℃条件下封闭1h；之后用150μL，1×PBST溶液清洗正负筛通道；

(2)第一轮筛选：将0.5nmol，125μL原始文库在95℃加热5min，并立即在冰上冷冻10s；再用注射泵以2.5μL/min流速将文库输进正筛通道，在常温条件下反应50min；之后以15μL/min流速通入150μL，1×PBS缓冲溶液以除去正筛通道中未结合的ssDNA序列；轻轻撕掉PDMS层，使用Luxscan～10K/A微阵列扫描仪扫描芯片；最后用DPEC水在95℃下加热5min洗脱乳铁蛋白结合的ssDNA序列，所得溶液在50℃条件下高纯氮吹干至体积为69μL；

(3)PCR扩增过程：将步骤(2)所得溶液分为体积均为23μL的3份相同溶液，每份依次加入25μL，2×Taq聚合酶,1μL，20μM TAMRA标记的前向引物和1μL，20μM生物素化的后向引物，混合均匀后进行PCR扩增；PCR的热循环过程如下：94℃5min；循环94℃30s，60.5℃30s，72℃30s过程10轮，72℃5min终止反应；该步骤获得的产物稀释10倍后作为模板进行再一次扩增：取5μL稀释后PCR产物与25μL，2×SYBRPremix Ex Taq^TM酶,1μL，20μM TAMRA标记的前向引物，1μL，20μM生物素化的后向引物以及18μL DPEC水充分混合均匀，PCR扩增每进行一轮便取10μL样品至微孔板中用BioTek检测其荧光信号，荧光信号最高者作为最佳轮数，剩余产物均扩增该轮数；

(4)分离纯化：将步骤(4)得到的PCR产物与600μL Promega磁珠充分混匀，在摇床上快速摇动1h后除去上清液；再加入25μL，50mM NaOH涡旋5min将磁珠上连接的双链解离；吸取上层清液并依次加入12.5μL 100mM HCl，25μL H₂O，62.5μL2×PBSM中和，所得的溶液作为下一轮筛选的次级文库,其含量约为40pmol；

(5)第二轮筛选：用泵以2.5μL/min流速将文库输进负筛通道，在常温条件下反应50min；再用泵以2.5μL/min流速将文库输进正筛通道，在常温条件下反应50min；接着以15μL/min流速通入150μL 1×PBS缓冲溶液除去正筛通道中未反应的链；轻轻撕掉PDMS层，使用Luxscan～10K/A微阵列扫描仪扫描芯片；最后用无核水在95℃下加热5min洗脱蛋白结合的链，所得溶液在60℃吹干至体积为92μL，留作PCR扩增；

(6)重复步骤(4)、(5)、(6)至第八轮筛选；

(7)将筛选的第五、六、七轮PCR扩增产物送至上海生工测序，每轮随机选取120条测序，再用IDT软件对得到的链进行二级结构分析，最终获得最佳的适配体。

实施例2：荧光偏振法对乳铁蛋白标准样品进行检测：

(1)在10μL,250nM FITC(异硫氰酸荧光素)标记的适配体N2(碱基序列：AGGCAGGACACCGTAACCGGTGCATCTATGGCTACTAGCTTTTCCTGCCT)溶液中加入100μL浓度为25μg/mL的乳铁蛋白标准样品，充分混匀。